發(fā)布時(shí)間：2020-11-01 05:32

　　 背景和目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brian injury,TBI)是威脅人類生命的重大疾病,具有高致殘、致死特點(diǎn),目前尚缺乏有效的藥物干預(yù)手段。TBI病理生理機(jī)制復(fù)雜,繼發(fā)的凝血功能障礙(TBI associated coagulopathy,TBI-AC)及血腦屏障破壞被認(rèn)為與其不良預(yù)后相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn),TBI急性期粘附配體血管性血友病因子(von Willibrand factor,VWF)水平升高且粘附活性增強(qiáng),通過與腦源性微囊泡(brain-derived microvesicles,BDMVs)結(jié)合,協(xié)助BDMVs破壞血腦屏障及引起TBI-AC。有研究證明純化的VWF-A2片段可抑制血小板與VWF以及血小板與纖維蛋白的相互作用。本研究擬通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達(dá)、純化獲得高純度重組VWF-A2蛋白,腹腔注射干預(yù)TBI小鼠。探索VWF-A2對(duì)TBI小鼠血腦屏障及凝血系統(tǒng)的影響,同時(shí)探索其可能的作用機(jī)制,為TBI患者藥物治療提供新思路。方法:(1)通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達(dá)、純化獲得重組VWF-A2蛋白(組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記)。通過凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡法及金屬酶ADAMTS-13體外酶切實(shí)驗(yàn)對(duì)VWF-A2進(jìn)行鑒定和初步功能性研究。(2)通過液壓打擊儀制備C57BL/6J小鼠重型TBI模型,傷后30 min腹腔注射VWF-A2(4 mg/kg),檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)VWF-A2循環(huán)血濃度。評(píng)估VWF-A2對(duì)TBI小鼠傷后3天內(nèi)死亡率的影響,改良版神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能預(yù)后。(3)伊文氏藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TBI小鼠血腦屏障通透性。蘇木精-伊紅染色評(píng)估TBI小鼠肺組織血管滲出情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)循環(huán)血MVs水平。Transwell小室系統(tǒng)和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)VWF-A2對(duì)TBI小鼠外周血源性MVs及體外凍融勻漿法制備的BDMVs介導(dǎo)的內(nèi)皮屏障破壞的影響。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TBI小鼠循環(huán)血VWF抗原、D-二聚體和纖維蛋白原含量及VWF結(jié)合膠原能力。磷鎢酸-蘇木精染色評(píng)估TBI小鼠腎臟纖維素沉積情況。凝血酶生成實(shí)驗(yàn)和活化凝血因子X凝血時(shí)間檢測(cè)MVs介導(dǎo)的凝血反應(yīng)。流式細(xì)胞儀和血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血小板激活水平及血小板計(jì)數(shù)。小鼠斷尾流血時(shí)間檢測(cè)TBI小鼠出血傾向。(5)免疫共沉淀法及表面等離子體共振技術(shù)檢測(cè)TBI小鼠循環(huán)血及體外VWF與VWF-A2相互作用。同時(shí)評(píng)估VWF-A2對(duì)瑞斯托霉素輔因子活性和剪切力誘導(dǎo)的血小板聚集的影響。結(jié)果:通過VWF-A2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、表達(dá)、純化成功獲得大量高純度重組VWF-A2蛋白(純度90-95%),金屬酶ADAMTS-13可有效酶切VWF-A2,證明了其具有生物學(xué)活性。VWF-A2可減少TBI后循環(huán)血中攜帶VWF的腦源性、血小板源性及內(nèi)皮細(xì)胞源性MVs釋放,抑制VWF協(xié)助下BDMVs介導(dǎo)的血腦屏障破壞及內(nèi)皮細(xì)胞激活,同時(shí)降低了TBI小鼠死亡率,改善存活小鼠神經(jīng)功能預(yù)后。同時(shí),VWF-A2可減少TBI后高活性VWF的釋放并能抑制其粘附活性,減輕VWF引起的血小板激活及血小板減少癥。此外,VWF-A2對(duì)凝血及纖溶級(jí)聯(lián)反應(yīng)也有抑制作用,表現(xiàn)為減輕了MVs介導(dǎo)的凝血酶生成及活化凝血因子Xa凝血反應(yīng),D-dimer水平下降,纖維蛋白原水平上升,并且緩解了TBI后出血傾向但不引起正常老鼠出血傾向。最后,通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)VWF-A2可結(jié)合到活化VWF暴露的A1結(jié)構(gòu)域,抑制其活性,表現(xiàn)為減輕瑞斯托霉素或剪切力誘導(dǎo)的血小板聚集。結(jié)論:本研究成功純化重組VWF-A2蛋白,證明VWF-A2可減輕TBI小鼠血腦屏障及凝血系統(tǒng)損害,降低死亡率,改善神經(jīng)功能預(yù)后。其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能是結(jié)合并抑制了TBI后釋放的高活性VWF功能,提示了其作為藥物開發(fā)的可行性,為TBI藥物治療提供新思路。同時(shí),VWF-A2還可能成為特異性檢測(cè)高活性VWF的新手段,用于診斷血栓性血小板減少性紫癜、嚴(yán)重感染等疾病。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

MVs 經(jīng)鼠尾靜脈注入正常 C57BL/6J 小鼠，小鼠表現(xiàn)出與遭受 TBI狀態(tài)。同時(shí)，血腦屏障及肺組織微血管完整性均遭到了破壞，隨實(shí) BDMVs 可在血小板協(xié)助下介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活和內(nèi)皮屏障的破壞等[13]通過乳凝集素（Lactadherin，LAC）清除 TBI 小鼠循環(huán)血 MI 后血腦屏障破壞和高凝血狀態(tài)得到了明顯改善。Wu 等[14]研究發(fā)友病因子（von Willibrand factor，VWF）在 TBI 后大量釋放，其粘并能與 BDMVs 結(jié)合，協(xié)助 BDMVs 引起內(nèi)皮損傷和 TBI-AC。綜圖見圖 1）：VWF 協(xié)助 BDMVs 破壞血腦屏障，進(jìn)入外周同時(shí)激活細(xì)胞，并產(chǎn)生血小板和內(nèi)皮細(xì)胞來源的 MVs，這些 MVs 同樣攜帶表面 TF 可啟動(dòng)外源性凝血途徑，進(jìn)而啟動(dòng)內(nèi)源性凝血途徑，而 PS應(yīng)提供了磷脂表面，加上 TBI 后結(jié)合到 MVs 上的 VWF，這使循大量的移動(dòng)“凝血平臺(tái)”，造成系統(tǒng)性高凝狀態(tài)，并迅速進(jìn)展為消。這就解釋了單純 TBI 造成的局部損傷是如何播散而引發(fā)早期全和高纖溶狀態(tài)的。

后在高爾基體中通過 N 端二硫鍵形成多聚體。在糖基化和裂解去成熟 VWF[16-18]。多數(shù) VWF 在正常生理情況下釋放入血，少數(shù)胞的 Weibel-Palade 顆粒和血小板的 α-顆粒中，形成具有高度促血超大 VWF（Ultralarge VWF, ULVWF），分子量 500-20000 kDa，在內(nèi)皮細(xì)胞或血小板釋放[19, 20]。循環(huán)血中 VWF 折疊成球形，僅 V暴露便于與膠原結(jié)合。而與之相反，VWF-A1 和 VWF-A2 結(jié)構(gòu)域球形結(jié)構(gòu)中，避免生理情況下捕獲、激活血小板（GPIbα-VWF-A ADAMTS-13（a disintegrin and metalloprotease with thrombospond 13）切割（VWF-A2 結(jié)構(gòu)域內(nèi) Tyr1605-Met160 間肽鍵）[21, 22]。，ULVWF 釋放入血，形成螺旋狀長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)通過 VWF-A3 結(jié)構(gòu)域錨原，此時(shí) VWF-A1 與 VWF-A2 的結(jié)合被打破，暴露功能位點(diǎn)：V血小板粘附、激活及聚集，而 VWF-A2 則可被金屬酶 ADAMTS-1過度的促血栓形成活動(dòng)。生理狀態(tài)下，ULVWF 的分泌與裂解處于，當(dāng) VWF 異常增多或 ADAMTS-13 減少時(shí)，機(jī)體易發(fā)生凝血功能紊]。

1.1.1A：LB 固態(tài)培養(yǎng)皿，內(nèi)含單個(gè)細(xì)菌菌落。B：滅菌槍頭挑取單個(gè)菌中振蕩培養(yǎng)。C：超聲破碎后菌液。 將上述 2 mL 菌液置于 1 LLB 選擇培養(yǎng)基（含抗生素）中，繼續(xù)m/s 振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。 取 1mL 菌液于酶標(biāo)儀專用檢測(cè)管中，600 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（如達(dá)不到，則繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，培養(yǎng) 6 h 后可達(dá)到目標(biāo)吸光度4 VWF-A2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)吸光度達(dá)標(biāo)后，向 1 L 菌液中加入終濃度為 0.5mM 的 IPTG，于 4 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h 以誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白 VWF-A2 的表達(dá)。5 冰浴超聲破菌 72 h 后，將菌液置于 400 mL 離心瓶中 4 ℃下 6000 rpm 離心 10 m25 mLPBS 緩沖液（pH 7.4）重懸菌體并轉(zhuǎn)移至鋁制超聲破碎瓶中超聲破碎，超聲破碎儀參數(shù)為：恒定功率 300 W，工作 3 s，間隔 。超聲破碎時(shí)應(yīng)注意探頭不能觸碰鋁瓶瓶底或側(cè)壁，以免損壞機(jī)器
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