發(fā)布時間：2020-10-21 12:24

　　 目的:熱射病(heatstroke,HS)是一種危及生命的疾病,熱應激時在各類細胞因子和炎癥因子的共同作用下,內皮細胞(endothelial cell)早期即可被激活且功能受損,而損傷的內皮細胞可進一步加重炎癥反應,最終導致多器官功能衰竭的發(fā)生。丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)在血管內皮保護中具有許多作用。目前研究表明,STS能夠抑制人臍靜脈內皮細胞凋亡,并減輕高溫引起的大鼠體內的炎癥反應。因此,探討STS治療對熱打擊的內皮細胞的影響對于防治中暑及闡明高熱對內皮細胞的損傷機制具有重要的理論與實踐意義。綜上,本研究旨在闡釋丹參酮IIA磺酸鈉(TanshinoneIIA sulfonate,STS)治療對熱打擊內皮細胞的影響以及細胞對STS治療的反應機制。方法:1.CCK-8法檢測人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞在42℃暴露不同時長的細胞活性,Annexin V/PI流式細胞術檢測熱誘導不同時長對HUVEC細胞凋亡率的影響,Western-blotting檢測熱誘導后HUVEC細胞中凋亡相關分子變化,探討熱誘導對HUVEC細胞凋亡水平的影響。2.HUVEC細胞在STS不同濃度作用下細胞活性改變,及熱誘導后恢復不同的時長HUVEC細胞的活性改變,以此篩選STS的作用濃度,和熱誘導后的恢復時間。3.CCK-8法檢測HUVEC細胞在STS作用下細胞活性的變化,Annexin V/PI流式細胞術檢測STS對熱誘導的HUVEC細胞凋亡率的影響,利用caspase活性檢測試劑盒檢測凋亡效應酶Caspase-3的活性。探討STS在熱誘導的環(huán)境中對HUVEC細胞的保護作用。4.探討STS對熱誘導引起HUVEC細胞凋亡影響的機制。硝酸鹽/亞硝酸鹽比色分析法檢測STS對熱誘導不同時長HUVEC細胞中亞硝酸鹽產量的影響,western blot檢測不同時間點eNOS的磷酸化水平,利用eNOS的抑制劑L-NMMA阻斷eNOS的磷酸化,檢測STS對阻斷eNOS后HUVEC細胞中eNOS磷酸化的影響、STS對高溫引起的HUVEC細胞活性及細胞凋亡率的影響。初步探討NO與熱誘導引起的HUVEC細胞凋亡的相關性。5.探討熱誘導的HUVEC細胞中eNOS的磷酸化是否由Akt的磷酸化而調節(jié)。利用western blot檢測STS對熱誘導不同時間點HUVEC細胞中Akt磷酸化情況的影響,STS對阻斷Akt磷酸化后HUVEC細胞中eNOS的影響,利用了Akt的抑制劑MK-2206后,利用western blot檢測STS對熱誘導不同時間點HUVEC細胞中Akt磷酸化情況。6.探索STS誘導的Akt磷酸化或eNOS磷酸化是否通過PI3激酶依賴的調控機制所控制。利用PI3K抑制劑Wortmannin,western blot檢測高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細胞中磷酸化的Akt及磷酸化的eNOS的變化。抑制劑MK-2206、Wortmannin對熱誘導下HUVEC細胞凋亡的影響。結果:1.HUVEC細胞在42℃暴露不同時長細胞活性隨時間延長而降低,熱誘導不同時長HUVEC細胞凋亡率隨時間延長而增高,熱誘導后HUVEC細胞中cleaved-caspase-3隨時間延長而蛋白表達水平增高。2.STS作用濃度為2μg/ml時,熱誘導后的HUVEC細胞活性有明顯改善;在恢復2小時時STS的保護作用已顯現(xiàn);當恢復時間越來越長,細胞在無藥物作用下活性也會有一定程度的回升,且即使STS作用濃度非常低(0.002μg/ml)也能有保護細胞的作用。3.在暴露于42℃中1小時后,可以觀察到在熱誘導后細胞有變圓和脫落的現(xiàn)象,而用STS(2μg/ml)處理后這種現(xiàn)象有了明顯的減輕。從細胞活性檢測的情況看,在暴露于42℃中1小時后,可以觀察到在熱誘導后細胞活性降低,而用STS(2μg/ml)處理后細胞活性有了一定程度的回升。在用STS(2μg/ml)處理后再將細胞暴露于42℃中1小時,相對于STS未處理的熱誘導組細胞,STS處理后使熱誘導的HUVEC細胞凋亡率明顯減少,結果具有顯著的統(tǒng)計學差異。熱誘導的HUVEC細胞在STS作用后,凋亡效應酶Caspase-3的活性降低。探討STS在熱誘導的環(huán)境中對HUVEC細胞的保護作用。4.在沒有STS處理時,熱誘導下HUVEC細胞的亞硝酸鹽生成量在0.5小時顯著增加,1和2小時急劇下降,亞硝酸鹽產量在2小時處于基線水平。而經STS(2μg/ml)處理的HUVEC細胞,在熱誘導后細胞中亞硝酸鹽的生產逐漸增加,在1小時達到穩(wěn)定狀態(tài),顯著高于同時期未用STS處理的HUVEC細胞中亞硝酸鹽的水平。HUVEC細胞中的eNOS蛋白磷酸化水平在熱誘導后15分鐘和30分鐘時有所增加,在1小時和2小時時eNOS的磷酸化又有所降低,經過STS(2μg/ml)處理后,HUVEC細胞中eNOS磷酸化從熱誘導后15分鐘到1小時呈持續(xù)增加。在L-NMMA預處理后,即使有STS的作用,HUVEC細胞在熱誘導后,eNOS的磷酸化水平無明顯改變。此外,L-NMMA的預處理使高溫引起的HUVEC細胞活性減弱,在STS作用后情況并無改觀。同樣,L-NMMA的預處理使高溫引起的HUVEC細胞cleaved-caspase-3表達增多,STS作用對這個情況也無改觀。5.在沒有STS處理的情況下,和熱誘導1小時和2小時相比,在熱誘導15分鐘和30分鐘時HUVEC細胞中磷酸化Akt水平增高。然而,如果經STS(2μg/ml)作用后,Akt磷酸化隨時間的延長持續(xù)增加,在1小時時趨于穩(wěn)定。MK-2206預處理后,熱誘導的HUVEC細胞在MK-2206預處理后可以抑制STS誘導的eNOS磷酸化增強,同樣,MK-2206預處理可顯著抑制STS對高溫下HUVEC細胞中亞硝酸鹽產量的影響。6.Wortmannin抑制了高溫環(huán)境下STS引起的HUVEC細胞中eNOS和Akt的磷酸化的增強。此外,Wortmannin的預處理也可以抑制STS引起的高溫時HUVEC細胞中增加亞硝酸鹽的含量。MK-2206預處理導致熱誘導的HUVEC細胞凋亡比例的增加,這一情況無論是否加入STS都無法改變。MK-2206預處理導致熱誘導的HUVEC細胞中裂解的caspase-3表達增高,這一情況同樣不受STS的影響。結論:1.熱應激可誘導HUVEC細胞凋亡,隨著熱誘導時間的延長凋亡率增加;2.適量的STS可以抑制熱應激引起的HUVEC細胞凋亡;3.STS作用可以激活PI3K/Akt通路,使eNOS磷酸化增加,從而導致HUVEC在熱應激狀態(tài)下一氧化氮(NO)產生增多。STS可以通過PI3K/AKT/eNOS途徑抑制熱應激引起的HUVEC細胞凋亡。意義:本研究初步闡明了STS對熱誘導HUVEC細胞凋亡影響的相關作用機制,同時也反映出HUVEC細胞針對高熱做出的應答反應,為探尋熱射病損傷內皮細胞機制提供了實驗依據,也為輔助治療提供了潛在作用靶點。
【學位單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R594.12
【部分圖文】：

是由于與高熱引起的一些急性生理改變之間復雜的相互作用（例如，循環(huán)衰竭，??缺氧和代謝需求增加）而產生的，熱的直接細胞毒作用，與宿主炎癥和凝血反應。??這一系列事件導致微循環(huán)血流改變，導致血管內皮和組織損傷（如圖１－１所示）。??５??

參酮ＩＩＡ磺酸鈉預防血管內皮細胞凋亡的分子機制研究結?果??測熱誘導不同時長ＨＵＶＥＣ細胞的相對ＨＵＶＥＣ細胞活性產生的影響，我們用ＣＣＫ－８活露不同時間的ＨＵＶＥＣ細胞活性。ＨＵＶＥＣ細胞在４、０．５小時、１小時、１．５小時、２小時、２．５小時、３檢測細胞活性隨著時間的延遲而減少（圖２－１）。??－

２－２－１ＨＵＶＥＣ、（Ｃ）、（Ｄ）分別表示熱誘導０小時、１小時、２小時、４小時后Ａｎｎｅｘｉｎ?ＨＵＶＥＣ細胞的凋亡率。??１００－１??ｇ?一??ｗ?８０－?丁??ａ?？??＞?６０－??Ｉ?丁??＾?４０－?？??０?－Ｉ—??〇?２０．??Ｓ：??〇－＊—Ｉ?．?．??＾?＾?＾??Ｈｅａｔ?Ｔｒｅａｔｅｄ?Ｔｉｍｅ??圖２－２－１熱誘導不同時間點ＨＵＶＥＣ細胞凋亡率統(tǒng)計??
【參考文獻】

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本文編號：2850112