核因子κB活化與成纖維細胞表型轉化在肺間質(zhì)纖維化中的作用

發(fā)布時間：2020-11-22 03:54

　　實驗目的間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病,他們在臨床表現(xiàn)、實驗室和病理學改變上具有一定共同特點,但又有各自不同的特征。成纖維細胞活化、增殖及大量細胞外基質(zhì)聚集是肺纖維化的主要病變特征,多種因素均可引起肺纖維化,如職業(yè)性粉塵(SiO_2等)、病毒(冠狀病毒等)、放射性損傷及某些藥物(博萊霉素等),此外還有一類不明病因的肺纖維化—特發(fā)性肺纖維化。雖然起因不同但纖維化的發(fā)展與結局基本相似,目前肺纖維化發(fā)生的確切機制尚不清楚,早期有效防治亦未獲得突破性進展。核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是大多數(shù)細胞因子表達的一個關鍵性轉錄調(diào)控因子,NF-κB的活化與肺間質(zhì)纖維化發(fā)病關系密切,阻斷NF-κB活化有可能是治療肺間質(zhì)纖維化的重要手段。NF-κB抑制蛋白(inhibitory NF-κB,IκB)是胞漿內(nèi)NF-κB的抑制物,對NF-κB的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。成纖維細胞轉化為表達α-平滑肌動蛋白的肌成纖維細胞在肺間質(zhì)纖維化病理過程中具有重要作用。本文旨在研究NF-κB的活化對肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的影響,以及在這一過程中,IκB對NF-κB的調(diào)節(jié)作用,從而為肺間質(zhì)纖維化的防治提供理論依據(jù)。實驗方法 1、動物模型的建立、分組將12只C57BL/6雌性小鼠(8周齡、體重18-20克、無特殊病原體SPF級、北京維通利華實驗動物技術公司)隨機分成兩組,每組6只。小鼠10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,無菌手術暴露氣管,模型組氣管內(nèi)注入博萊霉素A5(5mg/kg、日本化藥株式會社、批號:Y60520、溶于20μl的無菌生理鹽水)。對照組氣管內(nèi)注入生理鹽水20μl。 2、細胞培養(yǎng) 兩組小鼠分別于氣管內(nèi)注射處置后第1及第3天隨機取3只。用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)肺組織成纖維細胞,并傳4代。 3、成纖維細胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)過程中細胞的形態(tài)變化;免疫細胞化學方法鑒定波形蛋白和角蛋白的表達。 4、檢測指標及方法對原代培養(yǎng)并傳4代的細胞爬片進行p65、IκB-α及α-SMA免疫細胞化學染色以檢測各指標蛋白的表達,用原位雜交檢測p65及IκB-αmRNA的表達。并用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)對免疫細胞化學及原位雜交結果進行定量分析。分析各指標間相關性,研究成纖維細胞α-SMA的表達與NF-κB的關系。實驗結果 1、原代培養(yǎng)的成纖維細胞特征典型,并通過傳代培養(yǎng)得到了純化的成纖維細胞。培養(yǎng)細胞形態(tài)學變化:第3～4代細胞形態(tài)較為均一,呈長梭形,顯微鏡下可見1～2個核仁;細胞之間界限清晰,呈魚群狀或柵欄狀排列。 2、免疫細胞化學鑒定結果:免疫細胞化學檢測原代細胞表達波形蛋白強陽性,角蛋白散在灶性個別細胞弱陽性;第4代細胞均表達波形蛋白強陽性,角蛋白呈陰性表達。 3、在博萊霉素誘導的肺間質(zhì)纖維化的病理過程中,p65、IκB-α和α-SMA的蛋白及p65、IκB-α的mRNA表達均較對照組的表達明顯增強(P＜0.01)。 4、p65與IκB-α的蛋白表達呈正相關(r=0.801,P＜0.05),與α-SMA蛋白表達呈正相關(r=0.764,P＜0.05);p65與IκB-α的mRNA表達呈正相關(r=0.731,P＜0.05)。結論 1、采用組織塊帖壁培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)了肺成纖維細胞。 2、肺纖維化模型動物存在成纖維細胞向肌成纖維細胞的表型轉化,肌成纖維細胞的持續(xù)存在是肺纖維化發(fā)生的關鍵因素之一。 3、核因子κB活化可能在成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化中起關鍵性作用,并因此在肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要的作用。 4、IκB-α通過抑制NF-κB的活化發(fā)揮抗纖維化的作用。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

肺成纖維細胞,小鼠,角蛋白,陰性