發(fā)布時間：2020-11-22 03:54

　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病,他們在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室和病理學(xué)改變上具有一定共同特點(diǎn),但又有各自不同的特征。成纖維細(xì)胞活化、增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集是肺纖維化的主要病變特征,多種因素均可引起肺纖維化,如職業(yè)性粉塵(SiO_2等)、病毒(冠狀病毒等)、放射性損傷及某些藥物(博萊霉素等),此外還有一類不明病因的肺纖維化—特發(fā)性肺纖維化。雖然起因不同但纖維化的發(fā)展與結(jié)局基本相似,目前肺纖維化發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚,早期有效防治亦未獲得突破性進(jìn)展。 核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是大多數(shù)細(xì)胞因子表達(dá)的一個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,NF-κB的活化與肺間質(zhì)纖維化發(fā)病關(guān)系密切,阻斷NF-κB活化有可能是治療肺間質(zhì)纖維化的重要手段。NF-κB抑制蛋白(inhibitory NF-κB,IκB)是胞漿內(nèi)NF-κB的抑制物,對NF-κB的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表達(dá)α-平滑肌動蛋白的肌成纖維細(xì)胞在肺間質(zhì)纖維化病理過程中具有重要作用。本文旨在研究NF-κB的活化對肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響,以及在這一過程中,IκB對NF-κB的調(diào)節(jié)作用,從而為肺間質(zhì)纖維化的防治提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1、動物模型的建立、分組 將12只C57BL/6雌性小鼠(8周齡、體重18-20克、無特殊病原體SPF級、北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司)隨機(jī)分成兩組,每組6只。小鼠10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉后,無菌手術(shù)暴露氣管,模型組氣管內(nèi)注入博萊霉素A5(5mg/kg、日本化藥株式會社、批號:Y60520、溶于20μl的無菌生理鹽水)。對照組氣管內(nèi)注入生理鹽水20μl。 2、細(xì)胞培養(yǎng) 兩組小鼠分別于氣管內(nèi)注射處置后第1及第3天隨機(jī)取3只。用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)肺組織成纖維細(xì)胞,并傳4代。 3、成纖維細(xì)胞的鑒定 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞的形態(tài)變化;免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定波形蛋白和角蛋白的表達(dá)。 4、檢測指標(biāo)及方法 對原代培養(yǎng)并傳4代的細(xì)胞爬片進(jìn)行p65、IκB-α及α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色以檢測各指標(biāo)蛋白的表達(dá),用原位雜交檢測p65及IκB-αmRNA的表達(dá)。并用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)對免疫細(xì)胞化學(xué)及原位雜交結(jié)果進(jìn)行定量分析。分析各指標(biāo)間相關(guān)性,研究成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)與NF-κB的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞特征典型,并通過傳代培養(yǎng)得到了純化的成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:第3～4代細(xì)胞形態(tài)較為均一,呈長梭形,顯微鏡下可見1～2個核仁;細(xì)胞之間界限清晰,呈魚群狀或柵欄狀排列。 2、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)檢測原代細(xì)胞表達(dá)波形蛋白強(qiáng)陽性,角蛋白散在灶性個別細(xì)胞弱陽性;第4代細(xì)胞均表達(dá)波形蛋白強(qiáng)陽性,角蛋白呈陰性表達(dá)。 3、在博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化的病理過程中,p65、IκB-α和α-SMA的蛋白及p65、IκB-α的mRNA表達(dá)均較對照組的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。 4、p65與IκB-α的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.801,P＜0.05),與α-SMA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.764,P＜0.05);p65與IκB-α的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.731,P＜0.05)。 結(jié)論 1、采用組織塊帖壁培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)了肺成纖維細(xì)胞。 2、肺纖維化模型動物存在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化,肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。 3、核因子κB活化可能在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵性作用,并因此在肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要的作用。 4、IκB-α通過抑制NF-κB的活化發(fā)揮抗纖維化的作用。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

4代小鼠肺成纖維細(xì)胞角蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陰性X400

4代小鼠肺成纖維細(xì)胞波型蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性X400

對照組4代小鼠肺成纖維細(xì)胞P65免疫細(xì)胞化學(xué)染色，胞漿染色較淺，極少見胞核染色X400
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張曉曄;周妍;劉衛(wèi)青;李勝歧;趙立;;核因子κB在博萊霉素致小鼠肺纖維化病理過程中的動態(tài)表達(dá)[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年05期

2 衛(wèi)向陽,劉維永,孫國成,歐陽輝,顧春虎,劉興光;犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華外科雜志;2005年18期

3 龔華;張麗娜;艾宇航;劉志勇;;調(diào)控NF-κB/IκB炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對MODS大鼠炎性反應(yīng)的影響[J];中國急救醫(yī)學(xué);2007年09期

本文編號：2894076