發(fā)布時間：2020-11-21 10:58

　　 【研究背景】慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以氣流受限為主要特征的,可以預(yù)防,可以治療的疾病。COPD的氣流受限具有不完全可逆,呈進(jìn)行性發(fā)展的特點。COPD患病人數(shù)多,在世界范圍內(nèi)均有較高的死亡率,造成了嚴(yán)重的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),是全球性的公共健康難題。目前的研究結(jié)果表明,慢性煙草煙霧暴露可引發(fā)氣道以及肺部的異常炎癥反應(yīng),使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞發(fā)生活化,導(dǎo)致體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生增多,DNA雙鏈發(fā)生斷裂,引起DNA損傷反應(yīng),致使肺組織細(xì)胞出現(xiàn)衰老改變。同時,慢性煙草煙霧暴露可促使炎癥細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等細(xì)胞炎癥因子,促使更多中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤肺部。上述炎癥細(xì)胞在胞吞煙草煙霧等異物后,可分泌更多的促炎因子,后者在活性氧簇以及異物表面抗原分子的刺激下,介導(dǎo)固有免疫應(yīng)答及適應(yīng)性免疫應(yīng)答,進(jìn)而再次加重肺部的炎癥反應(yīng)。慢性煙草煙霧暴露是COPD發(fā)生發(fā)展的高危因素,其致病作用已引起臨床醫(yī)師及研究學(xué)者的高度關(guān)注。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lnc RNAs)是一類長度大于200個核苷酸的RNA分子,約占非編碼RNA的80%,主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。lnc RNAs可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個層面影響并調(diào)控機體中蛋白編碼基因的表達(dá)。近年來,隨著對lnc RNAs功能認(rèn)識的逐漸深入,越來越多研究表明,lnc RNAs的表達(dá)異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前,關(guān)于lnc RNAs與COPD發(fā)病的關(guān)系尚不清楚�！狙芯磕康摹勘菊撐闹荚谘芯縧nc RNAs在慢性煙草煙霧誘導(dǎo)的COPD模型小鼠肺組織中的表達(dá)變化及生物學(xué)功能,為進(jìn)一步揭示慢性煙草煙霧誘導(dǎo)COPD的病理生理機制提供線索�！狙芯糠椒ā�(1)以LPS聯(lián)合全身煙霧暴露的方式構(gòu)建COPD小鼠模型,正常對照組小鼠則飼養(yǎng)于清潔干凈環(huán)境中。造模結(jié)束后,測定兩組小鼠肺功能、肺泡灌洗液炎性細(xì)胞分類計數(shù)、Muc5AC含量、肺組織病理等。并對兩組小鼠提取肺組織中的RNA,進(jìn)行RNA測序及生物信息學(xué)分析,并從中選擇部分顯著差異表達(dá)的lnc RNAs及蛋白編碼基因進(jìn)行q RT-PCR驗證。通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫,獲取小鼠lnc RNAs和蛋白編碼基因的人類同源分子的堿基序列后,分別在CSE刺激16HBE和A549細(xì)胞中,以及COPD患者和健康對照組PBMCs中,進(jìn)行上述lnc RNAs和蛋白編碼基因的q RT-PCR驗證。(2)擴(kuò)大COPD患者的樣本量,分別在COPD患者和健康對照者的PBMCs中、煙草煙霧暴露7天和3個月的小鼠肺組織中、CSE刺激mle12細(xì)胞中,進(jìn)行Fantom3_F830212L20和Nqo1的檢測。【研究結(jié)果】1.lnc RNAs以及其相關(guān)的蛋白編碼基因在COPD模型小鼠肺組織中的表達(dá)變化以及生物信息學(xué)分析結(jié)果綜合COPD模型小鼠和對照組小鼠的肺功能、BALF炎性細(xì)胞分類計數(shù)、Muc5AC含量以及肺組織病理等結(jié)果,評估慢性煙草煙霧誘導(dǎo)COPD模型小鼠構(gòu)建成功。兩組小鼠肺組織RNA測序結(jié)果顯示,COPD模型小鼠肺組織中l(wèi)nc RNAs及m RNAs的表達(dá)水平,明顯不同于對照組小鼠。以fold change2及padj0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn),共有109個lnc RNAs和260個m RNAs在COPD模型小鼠及對照組小鼠肺組織中顯著差異表達(dá)。將顯著表達(dá)差異的lnc RNAs可能靶向的蛋白編碼基因,與260個顯著表達(dá)差異的m RNAs進(jìn)行交集后,共獲得44個與lnc RNA相關(guān)的,可能受lnc RNAs調(diào)控的,且本身也在COPD模型小鼠肺組織中顯著差異表達(dá)的蛋白編碼基因。對這些蛋白編碼基因進(jìn)行GO分析,結(jié)果顯示這些蛋白編碼基因主要富集在細(xì)胞對干擾素β反應(yīng)方面(基因生物學(xué)過程)、與GTP結(jié)合方面(分子功能)以及細(xì)胞漿方面(細(xì)胞組分)。KEGG分析結(jié)果顯示,這些蛋白編碼基因主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白加工處理以及牛磺酸和亞�；撬嵬�路的信號通路有關(guān)�；瘜W(xué)物富集分析結(jié)果顯示,這些蛋白編碼基因主要富集在煙草煙霧暴露的通路方面。從上述顯著表達(dá)差異的lnc RNAs和蛋白編碼基因中選擇相關(guān)系數(shù)0.95的lnc RNAs和蛋白編碼基因?qū)?構(gòu)建了lnc RNAs-蛋白編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。其次,將本論文研究中顯著表達(dá)差異的44個蛋白編碼基因,與GEO數(shù)據(jù)庫中COPD患者的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行交集后發(fā)現(xiàn),IL1R1、UCHL1、GGT5等3個蛋白編碼基因同時在COPD模型小鼠肺組織以及COPD患者肺組織和/或PBMCs中顯著表達(dá)差異。從顯著表達(dá)差異的lnc RNAs和蛋白編碼基因中,共挑選了14個lnc RNAs及14個蛋白編碼基因,在另外選取的COPD模型小鼠和對照組小鼠肺組織中進(jìn)行了q RT-PCR驗證分析,結(jié)果顯示這些lnc RNAs及蛋白編碼基因在COPD模型小鼠肺組織中的表達(dá)趨勢,與RNA測序結(jié)果顯示的表達(dá)趨勢一致。2.lnc RNAs人類同源分子以及其相關(guān)的蛋白編碼基因,在CSE刺激的16HBE細(xì)胞、A549細(xì)胞以及COPD患者PBMCs中的表達(dá)變化通過序列比對分析發(fā)現(xiàn),上述進(jìn)行了q RT-PCR驗證的14個lnc RNAs中,共有11個lnc RNAs能找到人類同源分子。q RT-PCR結(jié)果顯示,共有8個lnc RNAs人類同源分子(Fantom3_F830212L20、Fantom3_7420409G12、NR_028593、NR_033450、Fantom3_C130011B08、Fantom3_2810049O06、NR_102714、Fantom3_D330021G15)和7個蛋白編碼基因(UCHL1、NR1D2、PER3、HLF、AHRR、NQO1、SERPINA3)在CSE刺激的16HBE細(xì)胞中的表達(dá)趨勢,與它們在COPD模型小鼠肺組織中的表達(dá)趨勢相同;共有7個lnc RNAs的人類同源分子(Fantom3_C130011B08、Fantom3_7420409G12、Fantom3_D830009E10、NR_033450、NR_033355、NR_102714和Fantom3_F830212L20)和7個蛋白編碼基因(NR1D2、NQO1、AHRR、GGT5、HSPA5、FKBP4、UCHL1)在CSE刺激的A549細(xì)胞中的表達(dá)趨勢,與它們在COPD模型小鼠肺組織的表達(dá)趨勢相同;共有2個lnc RNAs人類同源分子(NR_102714和NR_028593)和7個蛋白編碼基因(UCHL1、DNAJA1、GGT5、FKBP4、IL1R1、HSPA1A和HSPA5)在COPD患者PBMCs中的表達(dá)趨勢與它們在COPD模型小鼠肺組織中的表達(dá)趨勢相同。3.COPD患者、煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠的氧化應(yīng)激指標(biāo),以及Fantom3_F830212L20(或其人類同源分子)和Nqo1表達(dá)水平的檢測COPD患者血漿以及煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠肺組織中GSSG等氧化應(yīng)激指標(biāo),較之對照組均有升高趨勢。其次,COPD患者PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1表達(dá)量較之健康對照組均有升高趨勢,且COPD患者吸煙量與其血漿GSSG水平以及PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的相對表達(dá)量均呈正相關(guān)。此外,煙草煙霧暴露7天及3個月小鼠肺組織中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA及蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組小鼠。4.CSE刺激mle12細(xì)胞中Fantom3_F830212L20、Nqo1 m RNA和蛋白表達(dá)水平的變化CSE刺激的mle12細(xì)胞中Fantom3_F830212L20及Nqo1 m RNA表達(dá)水平均隨CSE刺激濃度升高而升高,且Fantom3_F830212L20和Nqo1 m RNA相對表達(dá)量均隨CSE刺激時間延長而呈遞減趨勢。Nqo1蛋白表達(dá)水平則隨CSE刺激濃度升高而升高,并隨CSE刺激時間延長而升高。以si RNA沉默F(xiàn)antom3_F830212L20后,在0及0.5%CSE刺激下,mle12細(xì)胞內(nèi)Nqo1 m RNA及蛋白表達(dá)水平,以及細(xì)胞內(nèi)GSH水平,均低于對照組�！窘Y(jié)論】1.在煙草煙霧誘導(dǎo)的COPD模型小鼠肺組織中,共發(fā)現(xiàn)109個lnc RNAs及260個m RNAs顯著差異表達(dá)。這些差異表達(dá)的lnc RNAs相關(guān)的蛋白編碼基因的生物學(xué)功能主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工處理以及牛磺酸和亞�；撬嵝盘柾�路。2.Lnc RNA NR_102714(或NR_102714人類同源分子)及其相應(yīng)的蛋白編碼基因UCHL1在煙草煙霧誘導(dǎo)的COPD小鼠肺組織、CSE刺激的氣道上皮細(xì)胞以及COPD患者外周血PBMCs中均有相同的表達(dá)趨勢,提示它們可能共同調(diào)控COPD的發(fā)生發(fā)展。3.Lnc RNA Fantom3_F830212L20在煙草煙霧誘導(dǎo)的小鼠肺組織和肺泡上皮細(xì)胞中高表達(dá),可能正向調(diào)控Nqo1表達(dá),降低煙草煙霧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。4.在COPD患者PBMCs中,Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1表達(dá)量均高于正常健康者;COPD患者吸煙量與PBMCs中Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的表達(dá)量均呈正相關(guān)。Fantom3_F830212L20人類同源分子和NQO1的調(diào)控關(guān)系有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

圖 2 COPD 模型小鼠肺中，BALF 的炎性細(xì)胞分類計數(shù)、Muc5AC 含量以及肺泡平均截距Control 表示正常對照組小鼠，CS 表示 COPD 模型小鼠。(a) BALF 的炎性細(xì)胞分類計數(shù)；(b) BALF 的 Muc5AC 含量；(c) 肺泡平均截距。統(tǒng)計方法為 one-way ANOVA，**P＜0.01N=6。2122232425200.10.20.30.40.50.60.70.80.91Total Neutrophils Macrophages LymphocytesEosinophil******CelnumberinBALfluid(104/ml00.51Muc(foldof0102030405060Averagealveolarintercept(μm)**c Control CSControl CS

44圖 4 各個測序標(biāo)本 RNA 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估（a）表示測序數(shù)據(jù)(Raw Data)中帶接頭的 reads、低質(zhì)量 reads、包含 N（N 表示無法確定堿基信息）的 reads、包含核糖體 RNA 的 reads、其他不合格的不能用于數(shù)據(jù)分析的 reads，以及能用于數(shù)據(jù)分析的有效 reads 的百分比。（b）將有效的 reads 與小鼠參考基因組進(jìn)行序列比對后統(tǒng)計得到的 reads 在外顯子區(qū)、剪切區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、基因間隔區(qū)的分布百分比。（c）有效的 reads 在染色體上的分布情況。Sample 1～Sample 3為正常對照組小鼠的肺組織，Sample 4～Sample 6 為 COPD 小鼠模型的肺組織。

46 5 lncRNAs 和 mRNAs 在 COPD 模型小鼠和正常對照小鼠肺組織表達(dá)情況的聚類分ncRNAs；(b)mRNAs。熱圖中，每個小方格表示每個 lncRNAs 或 mRNAs。不同的顏色ncRNAs 或 mRNA 的表達(dá)量大小，表達(dá)量越大，顏色越深（紅色表示表達(dá)上調(diào)，綠色下調(diào)）。每行表示每個 lncRNAs 或 mRNAs 在不同樣本中的表達(dá)量情況，每列表示每
【參考文獻(xiàn)】

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1 王品;非編碼RNA對人NK細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞免疫功能的調(diào)控作用及相關(guān)機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

本文編號：2892909