發(fā)布時間：2024-05-19 06:06

　　【目的】構(gòu)建柑橘脈突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,為從分子水平解析其致病機理打下基礎(chǔ)�！痉椒ā坷�用SMARTer~?RACE(rapid amplification of cDNA ends)試劑盒對CVEV的5′序列進行RACE,并依據(jù)序列分析結(jié)果及CVEV分離株VE-1保守序列,設(shè)計CVEV基因組全長cDNA擴增引物。以CVEV毒源植株的總RNA為模板,通過EV25-F/EV5983-R引物擴增CVEV基因組全長cDNA。利用In-Fusion重組連接線性化pXT1和CVEV全長cDNA。通過菌液PCR及測序分析鑒定CVEV基因組全長cDNA克隆。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空浸潤接種摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、鄧肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克檸檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、棗陽小葉枳(P. trifoliata),進一步通過RT-PCR檢測、癥狀觀察鑒定所構(gòu)建CVEV全長cDNA...

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

圖1CVEV5′末端RACE及克隆

依據(jù)5′及3′端保守序列設(shè)計直接擴增CVEV基因組全長的引物EV25-F/EV5983-R。以2.1提取的總RNA為模板，進行CVEV的基因組全長RT-PCR。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2),PCR產(chǎn)物片段大小約5983bp，符合預(yù)期CVEV基因組全長大小，切膠回收備用。2.....

圖2CVEV的基因組全長RT-PCR

使用限制性內(nèi)切酶SmaI和StuI酶切pXT1雙元表達載體。將2.2獲得的RT-PCR產(chǎn)物和pXT1線性載體切膠回收、In-FusionHDCloningKit連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。挑取單菌落采用引物VE16-F/VE17-R進行菌液PCR篩選，然后采用引....

圖3CVEV全長cDNA克隆的PCR鑒定

圖2CVEV的基因組全長RT-PCR隨機選取6個陽性克隆，命名為CVEV1901—CVEV1906并進行序列測定。結(jié)果表明所獲克隆均符合CVEV基因組全長預(yù)期，序列之間的一致性為99.35%。其中，CVEV1901全長5983nt，由5個ORF、5′端207nt和3′端1....

圖4CVEV與黃矮病毒科中其他病毒全長基因序列的系統(tǒng)進化樹

將獲得的CVEV全長cDNA克隆CVEV1901和CVEV1902分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以pTX1空載體為陰性對照，真空浸潤接種尤力克檸檬實生苗。接種30d后，抽提系統(tǒng)新發(fā)葉片RNA進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明兩株CVEV1901接種的尤力克植株檢測出CVEV特異性條帶....

本文編號：3977705