有害層孔菌(Phellinus noxius)引起的橡膠樹(Hevea brasiliensis)褐根病是嚴重危害天然橡膠的一種根部病害。環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)由于特異性強、靈敏度高、反應(yīng)迅速、成本低等優(yōu)勢,已在植保等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。為了建立一種能夠快速、高效、準確地檢測橡膠樹褐根病菌的技術(shù),本研究以SYBR GreenⅠ為指示劑,建立了橡膠樹褐根病菌有害層孔菌的環(huán)介導等溫擴增可視化快速檢測方法。根據(jù)橡膠樹褐根病菌特異的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計了4條引物(2條內(nèi)引物FIP/BIP, 2條外引物F3/B3)進行LAMP擴增。對LAMP反應(yīng)條件和體系進行優(yōu)化,并進行特異性和靈敏度驗證,最后進行田間疑似褐根病樣本驗證。研究確定了最佳反應(yīng)體系(25μL中模板100 ng/μL,外引物F3/B3各0.2μmol/L,內(nèi)引物FIP/BIP各1.2μmol/L, dNTPs 1.4 mmol/L, Mg2+6 mmol/L,甜菜堿0.8mol/L, Bst DNA polymerase 8 U/μL)和反應(yīng)...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 供試菌株
        1.1.2 試劑
        1.1.3 儀器
    1.2 方法
        1.2.1 病原菌培養(yǎng)及核酸提取
        1.2.2 引物設(shè)計與合成
        1.2.3 LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化
        1.2.4 特異性驗證
        1.2.5 靈敏度檢測
            1.2.5. 1 基因組DNA靈敏度檢測
            1.2.5. 2 LAMP與普通PCR靈敏度比較
        1.2.6 田間樣本檢測
2 結(jié)果與分析
    2.1 LAMP檢測體系的優(yōu)化
        2.1.1 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化
        2.1.2 反應(yīng)條件優(yōu)化
    2.2 LAMP特異性檢測
    2.3 LAMP靈敏度檢測
        2.3.1 橡膠樹褐根病菌基因組靈敏度檢測
        2.3.2 LAMP與普通PCR靈敏度比較
    2.4 田間樣本檢測
3 討論
4 結(jié)論



本文編號：4002761