發(fā)布時間：2016-08-20 06:10

1 引言

猬實喜充分日照及排水良好的肥沃土壤，也能在干旱及瘠薄的土壤中生長，較為耐寒，在華北地區(qū)生長良好。猬實株叢姿態(tài)優(yōu)美，開花期正值早春諸花齊放之后（即初夏百花凋謝之時），開花繁盛，白中帶粉，可愛喜人；果實形如刺猬，夏秋成熟，，掛滿枝頭，觀賞價值較高，是華北地區(qū)春夏季節(jié)重要的花灌木。園林應(yīng)用采用孤植、叢植均美。多栽種于草坪種、山石旁、道路口和亭臺樓閣周圍，盆栽欣賞或作切花也非常別致。一直以來，因人類生產(chǎn)活動和猬實自身特性的影響，猬實自然群落分布分散，呈斑塊狀，野外生存面臨巨大威脅，國家環(huán)境保護總局在 1987 年《中國珍稀瀕危保護植物名錄》中將其定為三級稀有保護植物。瀕危植物是植物遺傳育種的珍貴材料，一個物種就是一個基因庫，是研究植物起源、進化的有力依據(jù)。目前猬實應(yīng)用于園林栽植尚不普遍，但它是一種在城市園林綠化中極有發(fā)展前途并值得大量推廣的觀賞花木。猬實常采用播種、扦插、分株繁殖，利用組織培養(yǎng)方法進行繁殖的研究較少，該研究的目的就是找出影響猬實組培的主要因素，建立猬實的再生體系，以滿足城鄉(xiāng)園林綠化的需求，并進行種質(zhì)資源保護。組織培養(yǎng)在猬實的化學誘變、基因遺傳轉(zhuǎn)化、優(yōu)良品種繁殖等方面具有獨特的價值和優(yōu)勢，可加速猬實的良種繁育進程。近些年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和基因工程育種技術(shù)的發(fā)展，多是以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)開展的。最近基因靶向剪切，定點敲除/敲入原理和技術(shù)研究，更為植物育種展示了無限的前景。木本植物育種周期長，通過組織培養(yǎng)結(jié)合這些新技術(shù)，可以大大縮短育種周期。完善猬實的組織培養(yǎng)技術(shù)可以加快品種培育速度，為培育新品種提供可靠的技術(shù)平臺。
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1.1 忍冬科植物組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀
忍冬科 18 屬約 500 余種，我國 12 屬約 300 余種。忍冬科植物觀賞價值較高，錦帶花屬（如海仙花）、猬實屬（猬實）、忍冬屬（如金銀木）、六道木屬（如糯米條）、莢蒾屬（如木繡球）和接骨木屬（如接骨木）等都是常見的觀賞植物�？偟膩碚f，對比草本植物，木本植物組織培養(yǎng)較為困難，離體培養(yǎng)成功率不高。并且關(guān)于木本植物離體培養(yǎng)的研究多集中在果樹、經(jīng)濟類樹種和少量林木，而對于園林觀賞木本植物的組織培養(yǎng)研究較少。某些植物種類難以進行植株再生和遺傳操作，親緣關(guān)系很近而基因型不同的品種對組織培養(yǎng)的反應(yīng)有很大差異。另外，簡單的培養(yǎng)細胞會導(dǎo)致非表型和非遺傳的變異等，這些都制約著其在品種改良中的應(yīng)用。外植體接種到培養(yǎng)基上，一般先進行細胞脫分化，即原來已分化的細胞逐漸失去原來的分化狀態(tài)，而進行細胞分裂，形成由一群薄壁細胞組成的愈傷組織或細胞團。愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)分化的激素等物質(zhì)刺激，經(jīng)過再分化，從而形成不同類型的細胞、組織或器官，進而獲得再生植株，這個過程就稱為愈傷組織的誘導(dǎo)分化。不同來源的愈傷組織，在顏色、結(jié)構(gòu)上都可能存在差異。它們的顏色可能是黃色或白色，它們的外觀可能是光滑的或是粗糙的，它們的結(jié)構(gòu)可能是致密的或是松脆的。一般而言以顏色鮮艷、生長旺盛、結(jié)構(gòu)松脆型的愈傷組織為好。成熟細胞恢復(fù)分裂活性、向分生狀態(tài)逆轉(zhuǎn)和形成脫分化的愈傷組織的現(xiàn)象稱之為脫分化。一般而言，外植體通常包含不同類型的細胞，因而脫分化形成愈傷組織，再生形成一個完整植株或植物器官的能力是異質(zhì)的。對于一個已分化的細胞，表達其全能性的過程應(yīng)該首先經(jīng)歷脫分化，而后再經(jīng)歷一個再分化的過程。再分化是指脫分化的細胞或組織在特定的條件下轉(zhuǎn)變成各種不同細胞類型的現(xiàn)象。
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2 材料與方法

2.1 試驗材料
所用材料一部分采自山東農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)，另一部分采自山東省泰安市泰山區(qū)紅門路樹木園。于 9~10 月采集當年生的成熟果實，凈種陰干后裝入牛皮袋中 4 ℃干燥保存。植株葉片和莖段于 4~5 月采取，隨用隨采。無菌葉片取自：種子經(jīng)過催芽處理后，在無菌條件下發(fā)芽獲得的試管苗葉片；滅菌莖段萌芽生長出的新葉。

2.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑組織培養(yǎng)選擇 
MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，碳源的選擇以蔗糖 30 g/L；瓊脂的濃度為8 g/L。生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）。細胞分裂素類植物生長調(diào)節(jié)劑：噻苯�。═DZ）、6-芐基嘌呤（6-BA）、玉米素核苷（ZT）。YEP 液體培養(yǎng)基：蛋白粉 2 g，酵母粉 2 g，Na Cl 1 g。加水定容至 200 m L，調(diào)節(jié)p H 至 7.0。YEP 固體培養(yǎng)基：蛋白粉 2 g，酵母粉 2 g，Na Cl 1 g，瓊脂粉 2 g。加水定容至 200m L，調(diào)節(jié) p H 至 7.0。GUS 染色液的配制主要參照 Jefferson（1987）的方法。（1）配制 50m M 磷酸鈉緩沖液（p H7.0）：A 液：稱取 Na H2PO4·2H2O 3.12 g 溶于無菌蒸餾水，定容至 100 m L。B 液：稱取 Na2HPO4·12H2O 7.7 g 溶于無菌蒸餾水，定容至100 m L。取 39 m L A 液與 61 m L B 液混合。（2）配制 X-Gluc 母液：稱取 5mg X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯），溶于 1 m L DMF（二甲基酰胺）。（3）染色液配制：磷酸鈉緩沖液 50 m M，0.1 % Triton X-100，K4 [Fe(CN)6] （亞鐵氰化鉀）5 m M，K3 [Fe(CN)6] （鐵氰化鉀）5 m M，X-Gluc 0.5 mg/m L。
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2.2 試驗方法
用不同濃度的赤霉素處理，以達到破除休眠的目的。去除果皮后，將種子浸泡在濃度為 50、100、150、200、250、300 mg/L 的赤霉素中 24 h，流水洗凈后播種。變溫層積處理是用高溫與低溫交替進行催芽的方法。先用高溫（15~25 ℃）后用低溫（0~5 ℃)，通過變溫模擬自然界層積的晝夜溫差效應(yīng)，使猬實種子在短時間內(nèi)達到層積的效果。試驗設(shè)定不同的變溫周期及循環(huán)次數(shù)，觀察其催芽效果。將種子用 5%的次氯酸鈉（Na Cl O）溶液浸泡 5 min 進行消毒，蒸餾水沖洗 4~5 次。將消毒后的種子放在墊有脫脂棉和濾紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫 25 ℃培養(yǎng)箱中催芽。每皿 30 粒種子為一個重復(fù)，每個處理 5 個重復(fù)。從播種第 7 天進行觀察，并在每天固定時間記錄種子萌發(fā)數(shù)，種子萌發(fā)以胚根達到種子長度的 1/2 為標志，如有霉爛的種子及時清除。計算在 30 天內(nèi)的發(fā)芽勢及最終發(fā)芽率。發(fā)芽率（%）= 發(fā)芽達到高峰期時正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供檢種子總數(shù)×100 %發(fā)芽勢（%）= 發(fā)芽達到高峰期時正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供檢種子總數(shù)×100%
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3 結(jié)果與分析..........17
3.1 猬實的播種繁殖.........17
3.2 再生體系的建立.........18
3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.......26
4 討論............29
4.1 種子休眠的破除.........29
4.2 再生體系的建立.........30
4.2.1 植物激素與再生體系........30
4.2.2 愈傷組織來源與芽分化..............31
4.2.3 溫度處理與芽分化............32
4.2.4 褐化現(xiàn)象........32
4.2.5 生根培養(yǎng)........33
4.3 遺傳轉(zhuǎn)化...........33
4.3.1 預(yù)培養(yǎng)時間..............34
4.3.2 農(nóng)桿菌濃度和侵染時間..............34
4.3.3 乙酰丁香酮濃度......35
4.3.4 共培養(yǎng)時間..............35
4.3.5 抗生素濃度..............35
5 結(jié)論............36

4 討論

4.1 種子休眠的破除

硬實是植物界存在的普遍現(xiàn)象，由于對胚生長的機械限制，導(dǎo)致種子休眠，而高溫浸種及酸蝕是解除許多硬實種子休眠的常用方法。高溫浸種可以軟化種皮，去掉種皮表層的蠟質(zhì)和油脂，提高透性和浸出種子內(nèi)發(fā)芽抑制物，促進萌發(fā)。溫度較低，軟化效果較差，溫度過高，容易燙傷種子。因此最佳處理為 80 ℃熱水浸種后，溫水浸種 48 h。猬實有堅硬果皮包被，濃硫酸處理果實 20 min 后，萌發(fā)率大幅提高，說明猬實果皮和種皮存在機械束縛，經(jīng)過短時間酸蝕處理，種殼變薄，增加透性，促進發(fā)芽且酸蝕處理后，果皮容易去除，方便播種；但酸蝕時間過長，很容易使種子受傷，影響種胚萌發(fā)。種子的休眠和萌發(fā)受植物體內(nèi)生長促進物質(zhì)與抑制物質(zhì)的平衡控制，在休眠種子中脫落酸含量很高，阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。赤霉素能促使營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成可溶狀態(tài)，同時也促進生長素的合成，從而打破種子休眠而促使萌發(fā)。試驗結(jié)果表明，外源赤霉素是破除猬實種子休眠的關(guān)鍵因素，適宜濃度的外源赤霉素能更好提高催芽效果。變溫處理能夠部分替代赤霉素處理的作用，適用于大量樣本播種。變溫周期 6 小時 15 次循環(huán)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢均到達最高。變溫處理通過模擬自然條件下的晝夜溫度變化，調(diào)控種子內(nèi)部激素代謝水平，溫度可控性更強，因此催芽時間大大縮短。機械束縛、抑制物質(zhì)和胚休眠是阻礙猬實種子萌發(fā)的主要因素，激素調(diào)節(jié)是破除休眠關(guān)鍵因素。試驗以 80℃熱水燙種后，溫水浸種 48 h 或用 98 %濃硫酸酸蝕 20 min，然后用 100 mg/L 赤霉素浸種 24 h，最終猬實種子發(fā)芽率超過 70 %，發(fā)芽勢達到 40 %以上。人工變溫處理能較好替代赤霉素處理的作用，最適為變溫周期 6 小時，經(jīng)過 15 次循環(huán)后播種。

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結(jié)論

（1）猬實的播種繁殖80 ℃熱水處理后溫水浸種 48 h 或用 98 %的濃硫酸處理 20 min，最后用 100 mg/L的赤霉素處理 24 h 能有效提高猬實種子萌發(fā)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，是高效的催芽手段。變溫周期 6 h，處理 15 個循環(huán)，能較好替代赤霉素處理的作用。
（2）愈傷組織培養(yǎng)選取無菌苗葉片為外植體，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇：MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 0.3 mg/L較為適宜。
（3）離體葉片芽再生多種處理結(jié)合，分階段培養(yǎng)能使愈傷組織獲得高芽效分化：先在高細胞分裂素濃度的芽分化培養(yǎng)基上（MS+6-BA 4.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L）培養(yǎng)一周；之后于不添加激素的 MS 培養(yǎng)基上進行一周的 4 ℃低溫培養(yǎng)，扣除生長激素；最后轉(zhuǎn)接到低細胞分裂素的芽分化培養(yǎng)基上（MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L + IBA 0.1 mg/L）。
（4）生根培養(yǎng)最適宜生根培養(yǎng)基是 MS+NAA 0.2 mg/L。
（5）遺傳轉(zhuǎn)化以葉片愈傷組織為受體，預(yù)培養(yǎng) 4 d，以濃度為 OD600=0.6 的菌液侵染 40 min，并附加乙酰丁香酮 100 μmg/L 共培養(yǎng) 3 d，能獲得較理想的轉(zhuǎn)化效果。50 mg/L 的卡那霉素和400 mg/L 頭孢霉素能起到很好的篩選效果。對轉(zhuǎn)基因外植體進行 GUS 染色，證明 GUS基因已整合到猬實基因組中。
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參考文獻(略)

本文編號：98575