發(fā)布時(shí)間：2017-05-11 08:21

大川芎方源于金·劉完素《宣明論方》,由川芎､天麻2味中藥組成,具有活血化瘀､平肝熄風(fēng)之功效,為治療偏頭痛的經(jīng)典復(fù)方,并已被開發(fā)成用于治療多種頭痛的中成藥(如天舒膠囊､天舒片､天舒滴丸等)｡而偏頭痛是臨床常見的､易反復(fù)發(fā)作的且發(fā)作時(shí)疼痛劇烈的頑固性疾病,以占主導(dǎo)地位的三叉神經(jīng)血管學(xué)說認(rèn)為,該病機(jī)理主要涉及到腦膜的血管擴(kuò)張､血管活性肽釋放引起神經(jīng)源性炎癥以及中樞疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)的功能異常｡正是這種復(fù)雜系統(tǒng)與復(fù)雜系統(tǒng)間的相互作用極大的限制了大川芎方及其相應(yīng)制劑的作用機(jī)制解析｡融合系統(tǒng)生物學(xué)(Systemsbiology)和多向藥理學(xué)(Polypharmacology)提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),利用網(wǎng)絡(luò)分析(Networkanalysis)理論從整個(gè)系統(tǒng)角度研究藥物作用機(jī)制,這為多成分藥物作用機(jī)制的闡釋提供了另一種研究策略｡
而中醫(yī)藥正是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下由一味或多味中藥合理配伍而成的復(fù)方,經(jīng)現(xiàn)代藥物化學(xué)研究,其恰好是多成分藥物的一種典型代表｡因此,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)思想正被引入到中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制研究中以闡釋其科學(xué)內(nèi)涵｡在此背景下,本文嘗試采用分子對(duì)接與網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合的方法來研究大川芎方治療偏頭痛的分子作用機(jī)制,進(jìn)而詮釋其臨床應(yīng)用的科學(xué)內(nèi)涵｡

1材料與方法

1.1靶蛋白與分子數(shù)據(jù)集構(gòu)建
通過文獻(xiàn)分析認(rèn)為,偏頭痛是血管神經(jīng)性腦部疾病,各種原因?qū)е履X膜血管擴(kuò)張,血漿外滲,造成腦膜周圍神經(jīng)炎癥,激活三叉神經(jīng)產(chǎn)生頭痛｡同時(shí),興奮的神經(jīng)釋放血管激活物質(zhì)和致痛物質(zhì),激活內(nèi)皮細(xì)胞､肥大細(xì)胞和血小板,進(jìn)而引起胞外胺類､AA類代謝物､肽類及多種離子增加,增強(qiáng)感覺神經(jīng)元的敏感性,造成頭痛增強(qiáng)延長｡基于發(fā)病過程分析,根據(jù)是否人源､晶體結(jié)構(gòu)分辨率以及是否含配體等方面從Uniprot數(shù)據(jù)庫和RCSB數(shù)據(jù)庫共篩選出21個(gè)含原配體靶蛋白晶體復(fù)合物｡同時(shí),根據(jù)大川芎處方組成,從UNPD數(shù)據(jù)庫檢索建立中藥川芎､天麻所含的111個(gè)小分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫｡

1.2分子對(duì)接
在建立的小分子三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和靶蛋白數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上,依據(jù)靶蛋白u(yù)niprot和化合物UNPD編號(hào)從TCMN數(shù)據(jù)庫篩選大川芎方中小分子與靶點(diǎn)的分子對(duì)接得分｡分子對(duì)接具體參數(shù)如下:以AutoDock4.0為內(nèi)核的DOVIS2.0平臺(tái)上完成分子對(duì)接,以原配體為活性中心,盒子大小為4nm×4nm×4nm,格點(diǎn)間隔為0.0375nm,分子構(gòu)象搜索采用拉馬克遺傳算法(LGA),初始種群數(shù)為150,平移步長為0.2nm,旋轉(zhuǎn)步長為50°,突變率為0.02,交叉率為0.8,局部搜索頻率為0.06,其余為默認(rèn)值｡

1.3網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
根據(jù)分子對(duì)接得分,在高于原配體基礎(chǔ)上,選取得分較高(Score≥5.5)的111個(gè)分子-靶蛋白數(shù)據(jù)對(duì)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò),并通過插件Networkanalyzer分析網(wǎng)絡(luò)特征,識(shí)別大川芎方主要活性成分群和可能靶蛋白,以闡釋其治療偏頭痛科學(xué)內(nèi)涵｡

2結(jié)果

2.1分子對(duì)接結(jié)果分析
在分子計(jì)算中,分子與靶蛋白對(duì)接得分越高,則分子與靶蛋白相互作用的可能性越大｡通過對(duì)大川芎方分子對(duì)接結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)與偏頭痛靶蛋白有較高對(duì)接得分(Score≥5.5)的38個(gè)分子(表2),其中32個(gè)分子(大部分屬于苯酞及苯酞二聚體類)來自川芎,6個(gè)分子(主要屬于酚類化合物)來自天麻｡對(duì)38個(gè)分子活性報(bào)道分析發(fā)現(xiàn),川芎內(nèi)酯I(Sen-kyunolideI,UNPD152094)可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的水平顯著提升疼痛閾值來緩解偏頭痛小鼠的疼痛;z-藁本內(nèi)酯(Z-ligustilide,UNPD37822)能抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的促炎反應(yīng)治療神經(jīng)元性炎癥反應(yīng);diligustilide(UNPD28251)能明顯抑制小鼠扭體次數(shù)｡綜述所述,這個(gè)38個(gè)分子可能是大川芎方發(fā)揮治療偏頭痛的活性成分｡

2.2活性成分的藥動(dòng)學(xué)分析
口服大川芎方后,其活性成分經(jīng)胃腸道吸收入血,再分布到病變部位發(fā)揮治療作用｡而這些活性分子透過生物膜屏障入血或到達(dá)病灶部位與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)｡因此,可通過刻畫分子結(jié)構(gòu)特征的分子描述符的分析來初步預(yù)測(cè)化合物進(jìn)入體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程｡
通過OpenBabel2.3.2對(duì)38個(gè)潛在活性分子進(jìn)行分子描述符計(jì)算和結(jié)構(gòu)特征的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表3),從MW､logP､HBAs和HBDs的均數(shù)和中位數(shù)可看出,絕大部分化合物均符合“類藥5規(guī)則”;分子描述符RBs和PSA均數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于13,中位數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1.4nm2,提示絕大部分化合物可能有較好口服生物利用度(≥20%)｡同時(shí),表3中顯示,在38個(gè)化合物中,大部分化合物的MW<450,HBDs<3,HBAs<7,RB<8,PSA<0.7nm2,進(jìn)一步提示這些潛在活性化合物在中樞神經(jīng)可能也有較高暴露量｡
另外,對(duì)大川芎方相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道顯示,ligustilide､butylphthalide､senkyunolideA､senkyunolideI等苯酞及苯酞二聚體類化合物可吸收入血,senkyunolideI等可移行入腦脊液,并分布到腦組織中,吻合了上述部分預(yù)測(cè)結(jié)果｡這也進(jìn)一步說明38個(gè)化合物可能是大川芎方的活性成分｡

2.3分子-靶蛋白作用網(wǎng)絡(luò)分析
分子對(duì)接結(jié)果顯示,38個(gè)活性化合物不僅僅與一個(gè)蛋白或生物通路作用,而是調(diào)節(jié)多個(gè)靶蛋白的多條生物通路,構(gòu)成成分與靶蛋白間的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò),這需要有效的數(shù)據(jù)分析方法來挖掘網(wǎng)絡(luò)特征,進(jìn)一步揭示大川芎方的主要活性成分群和作用機(jī)制｡作為計(jì)算機(jī)生物化學(xué)一個(gè)分支,網(wǎng)絡(luò)分析(Networkanalysis)為復(fù)雜數(shù)據(jù)關(guān)系研究提供了有效方法,并在醫(yī)藥領(lǐng)域中被廣泛用于病機(jī)分析､靶蛋白發(fā)現(xiàn)､老藥新用及作用機(jī)制預(yù)測(cè)等｡
在網(wǎng)絡(luò)分析中,網(wǎng)絡(luò)度(Degree)和介數(shù)(Betweenness,BW)兩個(gè)參數(shù)常被用于刻畫節(jié)點(diǎn)在維持分子-靶點(diǎn)治療網(wǎng)絡(luò)的重要性,進(jìn)而分析大川芎方治療偏頭痛的主要活性成分群和關(guān)鍵靶蛋白｡根據(jù)虛擬篩選結(jié)果,構(gòu)建了由38個(gè)分子和18個(gè)靶蛋白組成的大川芎方治療偏頭痛的分子-靶蛋白網(wǎng)｡整體網(wǎng)絡(luò)特征分析發(fā)現(xiàn),cDTN網(wǎng)由56個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成1個(gè)模塊,整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的度分布服從冪律函數(shù),且平均最短路徑3.19(整個(gè)網(wǎng)絡(luò)直徑6),表明cDTN網(wǎng)絡(luò)具有典型的無標(biāo)度(Scale-free)和小世界(Small-world)特性,是一個(gè)穩(wěn)健(Robustness)的生物網(wǎng)絡(luò),故cDTN網(wǎng)絡(luò)具有一定抗擾動(dòng)的能力,能保證處方在一定范圍內(nèi)的波動(dòng)不會(huì)影響其療效｡
進(jìn)一步局部網(wǎng)絡(luò)特征分析,發(fā)現(xiàn)16個(gè)分子具有較高網(wǎng)絡(luò)度和介數(shù),可與18個(gè)靶蛋白相互作用,在保證cDTN網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定方面具有重要作用,提示16個(gè)分子的變化更可能會(huì)破壞大川芎方分子-靶蛋白治療網(wǎng)絡(luò)的完整性,進(jìn)而嚴(yán)重影響治療偏頭痛的效果｡因此,這16個(gè)化合物可能是大川芎方主要活性成分群,也是其制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)｡
同時(shí),在分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)中靶蛋白節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征分析顯示,大川芎方中部分活性成分與一氧化氮合酶(iNOS,eNOS)､CGRP受體(CGRP1)作用,抑制血管激活物質(zhì)(NO,CGRP,SP)產(chǎn)生與釋放[10],與ACE作用促進(jìn)血管活性物質(zhì)(P物質(zhì)､緩激肽)降解,從而降低由NO-cGMP､CGRP通路介導(dǎo)的神經(jīng)性炎癥;同時(shí)與mPLA2､COX､PG-ES作用,抑制PGE2合成,與TNF-α和p38MAPK激酶(p38α,p38β)作用抑制TNF介導(dǎo)的硬腦膜血管感受器對(duì)傷害的增敏化,進(jìn)而緩解偏頭痛;還有部分化合物與NMDA受體(iGluR5)和AMPA受體(AMPA2)作用,對(duì)抗由谷氨酸鹽參與的偏頭痛發(fā)作時(shí)的皮層擴(kuò)布性抑制(Corticalsprea-dingdepression)的發(fā)生和傳播;另外,還有可與多巴胺受體(D2R)和阿片受體(κopioidreceptor),調(diào)控多巴胺能神經(jīng),抑制疼痛感受器信息傳輸｡前期實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道也部分證實(shí),大川芎方能降低偏頭痛模型大鼠的NOS､CGRP受體表達(dá)｡

3討論

隨著系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展,發(fā)現(xiàn)疾病是致病因素攻擊生物系統(tǒng),擾動(dòng)生物網(wǎng)絡(luò)的平衡,導(dǎo)致生物功能異常,最終造成特定疾病的形成,因此疾病可視為特定的生物網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng),與之對(duì)應(yīng)的藥物開發(fā)策略,也逐漸的由單靶點(diǎn)特異性設(shè)計(jì)向組合性多靶點(diǎn)藥物轉(zhuǎn)變,開始注重強(qiáng)調(diào)對(duì)整個(gè)生物系統(tǒng)的調(diào)整,但這種基于系統(tǒng)方法設(shè)計(jì)藥物還面臨著諸多挑戰(zhàn)｡
而中藥是以中醫(yī)理論為指導(dǎo),由單味或多味中藥組合配伍后,調(diào)整生物體環(huán)境,逐漸糾正失衡網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而達(dá)到治療疾病目的,這恰好吻合了多靶點(diǎn)組合藥物設(shè)計(jì)理念｡
目前,雖然對(duì)偏頭痛的治療選擇很有限包括用于急性發(fā)作時(shí)的色胺類藥物､用于預(yù)防發(fā)作的onabotulinumtoxinA及舒馬普坦,但對(duì)偏頭痛的病理生理研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)了一些新的病理機(jī)制｡同時(shí),對(duì)偏頭痛的治療也開始向多成分配伍方向發(fā)展｡而自金代以來,來自中醫(yī)藥的大川芎方已經(jīng)過豐富的臨床實(shí)踐,對(duì)偏頭痛有良好療效,但由于缺乏現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵詮釋,極大了限制其在現(xiàn)代臨床中的應(yīng)用｡本文利用分子對(duì)接構(gòu)建了大川芎方治療偏頭痛的分子-靶蛋白網(wǎng)絡(luò),并通過網(wǎng)絡(luò)特征分析,發(fā)現(xiàn)大川芎方中的ligustilide､bu-tylphthalide､senkyunolideA､senkyunolideI等16個(gè)主要活性成分通過與CGRP1､NOS､iGluR5､TNF-α等18個(gè)靶蛋白作用,抑制神經(jīng)源性炎癥和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生;降低硬腦膜血管感受器對(duì)傷害性信息的增敏化;對(duì)抗皮層擴(kuò)布性抑制(Corticalspreadingdepression)的發(fā)生和傳播,達(dá)到整體治療偏頭痛的目的｡
這些研究結(jié)果揭示了大川芎方的分子作用機(jī)制,闡釋了其治療偏頭痛的科學(xué)內(nèi)涵｡同時(shí),這也將有助于推動(dòng)大川芎方及其相應(yīng)制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和分子機(jī)制探索實(shí)驗(yàn)開展｡

參考文獻(xiàn):(略)

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本文編號(hào)：356781