金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)引起的奶牛乳腺炎目前尚無有效的商品化疫苗,而有研究發(fā)現(xiàn)相比S.aureus纖維連接素結合蛋白 B(fibronectin binding protein B,FnBPB)和凝集因子 A(clumping factor A,ClfA)兩種黏附素的重組蛋白FnBPB-ClfA,其IgG Fc段融合重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA刺激機體產(chǎn)生了更高水平的全身及乳腺局部體液免疫應答。因此,本研究對S.aureus黏附素重組蛋白與牛Fc融合后是否通過FcRn的參與提高抗原蛋白轉運效率進行了研究,隨后使用該融合重組蛋白為抗原的亞單位疫苗進行本動物的免疫效果評估,并研發(fā)一種比傳統(tǒng)方法使用簡便、省時省力的、可在奶牛接種疫苗前后進行免疫效果細菌學評價的鑒別顯色培養(yǎng)基。1.S.aureus基因工程亞單位疫苗抗原蛋白轉運效率的探究:將原代奶牛乳腺上皮細胞(primary bovine mammary epithelial cells,pbMECs)培養(yǎng)于Transwell至形成完整性較好的細胞屏障。此時細胞屏障上方加入重組蛋白及...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 奶牛乳腺炎分類
    1.2 奶牛乳腺炎的病原菌分類
        1.2.1 環(huán)境性病原菌
        1.2.2 傳染性病原菌
    1.3 奶牛乳腺炎的流行病學
        1.3.1 病原菌
        1.3.2 宿主
        1.3.3 傳播媒介
    1.4 奶牛乳腺炎的影響
        1.4.1 社會影響
        1.4.2 經(jīng)濟損失
        1.4.3 耐藥菌的傳播
    1.5 奶牛乳腺炎的防控
        1.5.1 外源性病原菌的防控
        1.5.2 臥床、墊料中病原菌的防控
        1.5.3 泌乳期病原菌的防控
        1.5.4 干乳期病原菌的防控
        1.5.5 其他飼養(yǎng)管理的加強
    1.6 奶牛乳腺炎的檢測方法
        1.6.1 病原菌分離培養(yǎng)、生化鑒定法
        1.6.2 鑒別培養(yǎng)基法
        1.6.3 MALDI-TOF法
        1.6.4 PCR法
        1.6.5 16S rRNA測序法
        1.6.6 其他基于基因型的鑒定方法
    1.7 奶牛乳腺炎的治療
        1.7.1 抗生素療法
        1.7.2 輔助治療
        1.7.3 加強合理治療的認識
    1.8 奶牛乳腺炎疫苗的研究進展
        1.8.1 大腸桿菌疫苗
        1.8.2 乳房鏈球菌疫苗
        1.8.3 S.aureus疫苗
    1.9 研究的目的與意義
2 研究一 S.aureus疫苗抗原蛋白跨乳腺上皮屏障轉運效率的探究
    2.1 試驗材料
        2.1.1 細胞及培養(yǎng)液
        2.1.2 主要試劑和材料
        2.1.3 儀器設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 重組蛋白的制備
        2.2.2 pbMECs體外胞吞轉運實驗
    2.3 結果
        2.3.1 重組蛋白的制備
        2.3.2 pbMECs的培養(yǎng)
        2.3.3 pbMECs屏障完整性的檢測結果
        2.3.4 pbMECs參與重組蛋白胞吞轉運
        2.3.5 重組蛋白在pbMECs胞內的轉運路徑
    2.4 討論
    2.5 小結
3 研究二 奶牛乳腺炎病原菌的分離鑒定
    3.1 試驗材料
        3.1.1 牛群
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 儀器設備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 牛奶樣品的采集
        3.2.2 病原菌的分離及初步鑒定
        3.2.3 病原菌的分子生物學鑒定
    3.3 結果
    3.4 討論
    3.5 小結
4 研究三 奶牛乳腺炎病原菌鑒別顯色培養(yǎng)基的研制
    4.1 試驗材料
        4.1.1 菌種
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 儀器設備
    4.2 試驗方法
        4.2.1 奶牛乳腺炎病原菌的分組鑒別
        4.2.2 各組病原菌特異性酶的篩選
        4.2.3 酶的保守性、特異性的驗證
        4.2.4 酶顯色底物的合成
        4.2.5 病原菌發(fā)酵產(chǎn)酸的碳源的篩選
        4.2.6 基礎培養(yǎng)基的選擇
        4.2.7 含有顯色底物和/或碳源的培養(yǎng)基顯色效果的評估
        4.2.8 鑒別顯色培養(yǎng)基成分的優(yōu)化
    4.3 結果
        4.3.1 奶牛乳腺炎病原菌鑒別的分組結果
        4.3.2 特異性酶的篩選結果
        4.3.3 酶特異性的驗證結果
        4.3.4 酶顯色底物的合成
        4.3.5 病原菌可發(fā)酵產(chǎn)酸的碳源
        4.3.6 含有顯色底物、碳源的培養(yǎng)基的顯色效果
        4.3.7 鑒別顯色培養(yǎng)基成分的優(yōu)化
    4.4 討論
    4.5 小結
5 研究四 鑒別顯色培養(yǎng)基法分離鑒定奶牛乳腺炎病原菌的評估
    5.1 試驗材料
        5.1.1 牛群
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 儀器設備
    5.2 試驗方法
        5.2.1 牛奶樣品的采集
        5.2.2 培養(yǎng)基的制備
        5.2.3 鑒別顯色培養(yǎng)基分離鑒定病原菌
        5.2.4 傳統(tǒng)的培養(yǎng)基輔以生化方法分離鑒定病原菌
        5.2.5 16S rRNA核酸序列測定鑒定病原菌
        5.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    5.3 結果
        5.3.1 乳腺炎牛奶樣品中病原菌在鑒別顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)
        5.3.2 鑒別顯色培養(yǎng)基與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定的一致性檢驗
        5.3.3 鑒別顯色培養(yǎng)基與16S rRNA測序鑒定的一致性檢驗
    5.4 討論
    5.5 小結
6 研究五 S.aureus亞單位疫苗本動物免疫試驗及免疫效果評估
    6.1 試驗材料
        6.1.1 試驗動物
        6.1.2 主要試劑和材料
        6.1.3 儀器設備
    6.2 試驗方法
        6.2.1 試驗動物的篩選與分組
        6.2.2 重組蛋白及疫苗的制備
        6.2.3 鑒別顯色培養(yǎng)基的制備
        6.2.4 免疫程序及樣品采集
        6.2.5 指標檢測
    6.3 試驗結果
        6.3.1 S.aureus亞單位疫苗本動物免疫效果增強驗證試驗
        6.3.2 S.aureus亞單位疫苗免疫效果評估試驗結果
    6.4 討論
    6.5 小結
7 全文結論
致謝
參考文獻
作者簡介



本文編號：3970502