發(fā)布時間：2020-11-20 01:10

　　 為研制農(nóng)藥特異性基因工程抗體,本研究以有機磷殺蟲劑三唑磷和對硫磷為目標分析物,采用一種新型水溶性免疫佐劑(快速佐劑)進行了三唑磷和對硫磷單克隆抗體(單抗)的制備。該免疫佐劑操作簡便,無需乳化,與人工抗原混合后可直接對Balb/c小鼠進行小腿肌肉注射,免疫脾細胞制備方便,細胞融合后篩選得到有效細胞株的陽性率超過30%;間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法(ic-ELISA)篩選獲得能夠穩(wěn)定分泌高親合力、高特異性抗體的雜交瘤細胞株,快速制備了針對農(nóng)藥三唑磷和對硫磷的高親合力單抗,靈敏度和特異性等方面與以往采用弗氏佐劑獲得的單抗相當,對三唑磷的識別靈敏度(IC50)0.91 ng/mL,對對硫磷識別靈敏度(IC50)8.18ng/mL。以制備的雜交瘤細胞株為RNA來源,采用抗體亞型特異性的簡并性引物,通過RT-PCR法擴增了抗對硫磷單抗的y1亞型重鏈可變區(qū)(VH)和κ亞型輕鏈可變區(qū)(VL)的基因序列,以及抗三唑磷單抗的γ1亞型VH和稀有的λ亞型VL基因序列,通過重疊延伸PCR法成功將相應(yīng)的VH、VL核苷酸序列經(jīng)連接肽(Gly4Ser)3串聯(lián),構(gòu)建了 VH-VL連接方式的單鏈抗體(scFv)全長序列。將抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv的全長序列依次構(gòu)建到大腸桿菌原核表達體系、桿狀病毒-昆蟲細胞表迗系統(tǒng)、畢赤酵母真核表達系統(tǒng)中進行可溶性表達,免疫印跡法鑒定蛋白表達,ic-ELISA法評價抗體活性。結(jié)果表明,抗三唑磷抗體和抗對硫磷抗體的VH和VL基因序列被成功擴增,在畢赤酵母表達體系中更經(jīng)濟有效地獲得了高活性的抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv,抗體活性與親本單抗相當,為進一步展開新型抗體的分子設(shè)計奠定了研究基礎(chǔ)。在明確表達體系的基礎(chǔ)上,研究了輕重鏈可變區(qū)取向(VH-VL、VL-VH)對抗三唑磷scFv、抗對硫磷scFv的生物活性和表達水平的影響。結(jié)果表明,輕重鏈可變區(qū)不同取向?qū)�抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv的親合力和特異性沒有明顯影響,產(chǎn)物具備特異性識別相應(yīng)靶標化合物的能力,對三唑磷的IC50在0.4～0.5 ng/mL,對對硫磷IC50在8.5～10.5ng/mL,抗體活性與親本單抗相當;相較而言,抗三唑磷scFv和抗對硫磷scFv在VL-VH取向下,更容易獲得較高水平的蛋白表迗,表達量均迗700mg/L左右。隨后,嘗試了兩個抗三唑磷scFv的串聯(lián),設(shè)計了不同輕重鏈可變區(qū)取向和連接肽長度的抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體,ic-ELISA法鑒定不同抗體的活性。結(jié)果表明,抗三唑磷雙價串聯(lián)單鏈抗體的抗體活性與連接肽長短[Gly4Ser、(Gly4Ser)3]、單價scFv的表達情況無關(guān),與輕重鏈取向有關(guān),輕鏈在N端的構(gòu)建方式更易獲得高識別能力的抗體蛋白,親合力(IC50在0.8～0.9 ng/mL)和特異性與親本單抗相當。在上述研究基礎(chǔ)上,設(shè)計了不同連接方式的三唑磷-對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體。ic-ELISA法鑒定結(jié)果表明,輕重鏈可變區(qū)取向同樣是影響三唑磷及對硫磷雙特異性串聯(lián)單鏈抗體識別能力的重要因素。其中,以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的構(gòu)建方式更容易獲得高識別能力的抗體,但對三唑磷和對硫磷的靈敏度均下降了近7倍,同時交叉識別譜發(fā)生了改變。綜上所述,在構(gòu)建高親合力單鏈抗體、雙價串聯(lián)單鏈抗體以及雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時,應(yīng)優(yōu)先考慮輕鏈可變區(qū)在N端的構(gòu)建方式;在設(shè)計雙特異性串聯(lián)單鏈抗體時,還需要考慮兩個scFv可變區(qū)片段之間的相互干擾導致抗體活性下降和非特異性結(jié)合的問題。最后,利用Accelrys公司的Discovery studioTM,根據(jù)抗體的氨基酸序列進行同源模建,構(gòu)建了抗三唑磷單鏈抗體和抗對硫磷單鏈抗體的三維模型。對抗體與農(nóng)藥小分子間的對接構(gòu)象進行了模擬,確定了對接過程中抗體的主要氨基酸作用位點。同時,結(jié)合表面等離子共振技術(shù)(SPR)測定抗體與小分子互作反應(yīng),明確了抗體與靶分子間結(jié)合的動力學和親合能力,為進一步提高抗體的親合力以及穩(wěn)定性奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：TQ450.1;Q78
【部分圖文】：

抗體的制備難度遠遠大于大分子材料。??目前，半抗原特異性單克隆抗體的來源主要有鼠源和兔源［３４－３６］。其中，報??道最多的是通過免疫小鼠制備單克隆抗體，其流程如圖１－２所示�？乖�免疫動??物的過程是制備單克隆抗體的第一步，也是直接關(guān)系到能否獲得所需要的具有??一定特異性的單克隆抗體的重要開端［３７１。半抗原的結(jié)構(gòu)對免疫應(yīng)答反應(yīng)的具有??一定影響，但免疫佐劑在該過程中同時發(fā)揮了不可忽視的重要作用，尤其是??弱免疫原性的抗原，免疫佐劑是促進其產(chǎn)生性能良好的單克隆抗體的關(guān)鍵因素??之一。理想化的免疫佐劑，應(yīng)對不同免疫原性的抗原均產(chǎn)生輔助增強作用，??即便是對弱免疫原性的抗原亦應(yīng)如此，在輔助產(chǎn)生具備良好性能抗體的同時，??也需考慮動物福利，減少炎癥或疼痛等不適感產(chǎn)生。據(jù)報道，在小分子化合物??單克隆抗體上應(yīng)用的免疫佐劑主要有弗氏佐劑和ＧＥＲＢＵＰ７］，ＴｉｔｅｒＭａｘ佐劑??單礎(chǔ)醜基脂質(zhì)Ａ佐劑Ｗ

ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＨ）和輕鏈的?Ｖ?區(qū)（ｌｉｇｈｔ?ｃｈａｉｎ?ｖａｒｉｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＶＬ）共同形成了??與抗原結(jié)合的區(qū)域，較錯區(qū)則保證了抗體分子在和結(jié)合抗原時較大的彈性。如??圖１－３?Ｂ，根據(jù)氨基酸變異程度，Ｖ區(qū)可再劃分為３個超變區(qū)或互補決定區(qū)??（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｈｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，?ＣＤＲ），此區(qū)域是抗體結(jié)合特異性抗原的??部位，化是獨特型決定簇的位點；而分隔開的４個區(qū)域被稱為框架區(qū)??（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＦＲ），組成了可變區(qū)穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)［６８］，而抗體可變區(qū)氨??基酸的多樣性使得獲得具有不同結(jié)合抗原特異性的抗體成為了可能。同時，隨??著抗體基因結(jié)構(gòu)的解析和闡明，基因工程技術(shù)開始應(yīng)用于抗體的分子設(shè)計和改??造，多種構(gòu)建模式和表這體系被應(yīng)用于重組抗體的制備，使得天然抗體的一些??７??

ｆｒａｇｍｅｎｔ?（ｓｃＦｖ）?ａｎｄ?ｄｓＦｖ??單域（單區(qū)）抗體（ｓｉｎｇｌｅ?ｄｏｍａｉｎ?ａｎ化ｏｄｙ，?ｓｄＡｂ），又稱納米抗體（ｎａｎｏｂｏｄｙ）??或重鏈抗體，是從駱駝科動物和１魚的血清中分離出的一種抗體，如圖１－５所??示，其體積約為傳統(tǒng)抗體的１／１２，并且這些重鏈抗體的親合為與傳統(tǒng)抗體分子??相當，因此同樣具有很強的抗原結(jié)合能為。另外很早就已有報道，傳統(tǒng)抗體分??子中抗原與抗體的結(jié)合并非需要整個抗體分子各部分的參與，在一些情況下，??僅僅需要一條重鏈或是輕鏈即可，通常更傾向于認為單獨的ＶＨ可レ乂保留相當??程度的抗原結(jié)合能為，其作用一般比ＶＬ大。因此，單域（單區(qū)）抗體亦指這??些單獨存在即能具有相當?shù)目乖�結(jié)合能為的ＶＨ或ＶＬ單功能結(jié)構(gòu)域分子，分??子量小、免疫原型低、不需ＶＨ和ＶＬ的棲互作用，具有相當?shù)目乖�親合性能，??正逐級成為一個研究的熱點方向
【參考文獻】

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本文編號：2890710