發(fā)布時(shí)間：2018-05-10 12:28

  本文選題：石斛 + 美孢膠膜菌　； 參考：《中國林業(yè)科學(xué)研究院》2017年博士論文

【摘要】：石斛為主要蘭科植物之一,主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶,我國大部分分布于西南、華南、臺(tái)灣等地。由于石斛種子極其微小,無胚乳,其自身營養(yǎng)不足以支持種子萌發(fā),自然條件下往往依賴與之共生的內(nèi)生真菌建立共生關(guān)系后才能夠發(fā)芽,石斛-菌根真菌的共生關(guān)系對(duì)于石斛種群繁衍極其重要。目前雖然已經(jīng)從蘭科植物中分離獲得多種共生真菌,但石斛-真菌共生分子機(jī)制研究卻相對(duì)滯后。本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建菌根真菌與石斛種子的共培養(yǎng)體系。利用RNA-seq技術(shù)對(duì)真菌與石斛共生和非共生狀態(tài)下的材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分別研究石斛在與真菌共生和非共生條件下石斛與真菌的基因表達(dá)模式和表達(dá)水平差異,挖掘與共生相關(guān)的關(guān)鍵基因,運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行全基因組預(yù)測(cè)分析,解析 石斛—菌根真菌‖共生分子調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.從6個(gè)春蘭和蕙蘭樣品中共分離到40種內(nèi)生細(xì)菌,分布在15個(gè)不同的屬內(nèi)。還分離得到3株潛在新菌。內(nèi)生細(xì)菌鑒定為后續(xù)蘭科植物與根際微生物共生機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。2.選用分離自湖北隨州野生春蘭(Cymbidium goeringii)根部的美孢膠膜菌菌株Tcg(Tulasnella calospora),利用8.0 g·L-1的燕麥培養(yǎng)基建立石斛種子與美孢膠膜菌共生萌發(fā)體系,通過臺(tái)盼藍(lán)染色在共生萌發(fā)的種子內(nèi)部檢測(cè)到共生真菌菌絲。3.采用RNA-seq技術(shù)對(duì)共生萌發(fā)種子(DoTcg)、非共生萌發(fā)種子(Do)、非共生美孢膠膜菌(Tcg)共9份樣品(每組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù))進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得96 G高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。樣品間生物學(xué)重復(fù)系數(shù)(R2)介于0.97-0.99之間,生物學(xué)重復(fù)性好。對(duì)石斛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行有參考基因組分析,45%-60%轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)mapping到石斛基因組上,其中比對(duì)到exon區(qū)域的reads比例在70%左右,比對(duì)到intron區(qū)域的reads數(shù)量最少,比對(duì)到基因間隔區(qū)的reads數(shù)量在25%左右。基于已發(fā)表的石斛基因注釋文件發(fā)現(xiàn)新的功能基因,并對(duì)已知基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,最終對(duì)16 872個(gè)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,可以對(duì)石斛基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充。4.美孢膠膜菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采取de novo拼接組裝,共獲得transcripts序列58 967條,其中長度大于1000 bp的unigenes序列為15 257條,占25.87%,N50 unigene序列長度為1 488 bp。在6個(gè)美孢膠膜菌轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)數(shù)約6.5-7.0萬,其中非編碼序列的SNP位點(diǎn)約為1.5-1.7萬,編碼序列的SNP位點(diǎn)約為5萬,其中大部分SNP位點(diǎn)為同義替換。5.對(duì)共生和非共生樣品中差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn),在石斛與菌根菌共生萌發(fā)的種子中預(yù)測(cè)獲得5類激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)差異表達(dá)基因:9個(gè)參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因、4個(gè)參與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因、15個(gè)參與IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因、1個(gè)參與油菜素甾醇信號(hào)通路基因、10個(gè)參與細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑基因。在共生菌根真菌美孢膠膜菌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)獲得6個(gè)差異表達(dá)的甘氨酸/絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因差異表達(dá)顯著,4個(gè)赤霉素受體蛋白基因GID1差異表達(dá)顯著,7個(gè)AUX/IAA家族蛋白基因差異表達(dá)顯著,3個(gè)生長素響應(yīng)和受體蛋白上調(diào)差異顯著。在共生萌發(fā)的種子與共生的美孢膠膜菌中均預(yù)測(cè)獲得一些與礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收相關(guān)的基因。在石斛6個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢測(cè)到44類共333個(gè)轉(zhuǎn)錄因子序列在共生與非共生萌發(fā)的種子中差異表達(dá)。這些在共生和非共生樣品中差異表達(dá)的基因可能參與石斛與菌根菌共生體系的建立。6.利用石斛已經(jīng)發(fā)表的genome數(shù)據(jù),采用生物信息學(xué)方法對(duì)石斛DoPC、DoWRKY家族基因進(jìn)行全基因組范圍內(nèi)預(yù)測(cè)分析,對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、基因進(jìn)化情況、及其在共生和非共生萌發(fā)種子中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)構(gòu)顯示:石斛全基因組中共預(yù)測(cè)到包含PCLD結(jié)構(gòu)域的38個(gè)DoPCs,可分屬4個(gè)亞家族,兩個(gè)Cys殘基在DoPCs家族中高度保守;19條DoPCs蛋白序列含有4個(gè)完整的保守銅結(jié)合配體(His、Cys、His、Gln/Met),有32條DoPCs骨架中含有N-端信號(hào)肽,22條DoPCs含有糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn),有27條DoPCs含N-糖基化位點(diǎn);16個(gè)DoPCs基因在與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的種子中檢測(cè)到表達(dá),其中DoUCL2,4和DoENODL14基因表達(dá)量最高,7個(gè)基因在共生萌發(fā)的種子中明顯上調(diào)表達(dá),只有DoENODL6基因明顯下調(diào)表達(dá)。本研究共獲得52條DoWRKY氨基酸序列,其中,7條序列含有2個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域,45條序列含有1個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域;選取DoWRKY基因上游1.5-kb區(qū)域序列,通過在線PLANTCARE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的預(yù)測(cè),結(jié)果對(duì)48條基因啟動(dòng)子區(qū)參與鹽/干旱誘導(dǎo)的MYB-binding位點(diǎn),低溫、真菌、MeJA和熱擊響應(yīng)元件等12種順式作用元件的種類及數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。所有在啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè)到順式作用元件的48個(gè)genes中,至少包含2種脅迫或激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件,說明它們可能參與多種脅迫或激素應(yīng)答。在共生萌發(fā)種子中共檢測(cè)到7個(gè)DoWRKY家族基因差異表達(dá),而且這些基因均在共生萌發(fā)的種子中上調(diào)表達(dá)。其中,DoWRKY08基因表達(dá)差異最顯著;DoWRKY20和31兩個(gè)基因在共生萌發(fā)的種子呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象。在全基因組范圍內(nèi)分析石斛DoPC、DoWRKY家族蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn),可以為探究蘭科植物與微生物共生的相互作用,進(jìn)一步解析蘭科菌根形成的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
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本文編號(hào)：1869313