發(fā)布時間：2018-04-18 02:41

  本文選題：水貂腸炎細(xì)小病毒 + VP2蛋白��； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎細(xì)小病毒(Mink enteritis parvovirus, MEV)引起的,以劇烈腹瀉為主要臨床特癥的急性、傳染性疫病,該病傳播速度快,幼貂致死率達(dá)80%,常對養(yǎng)貂業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。MEV作為貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus, FPV)的變種,屬于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒屬成員,基因組為單股負(fù)鏈DNA,包含兩個ORF,左端ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,右端ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2。NS1蛋白是多功能蛋白,調(diào)控病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。VP2蛋白是主要的衣殼蛋白,含有關(guān)鍵功能位點,參與調(diào)控病毒復(fù)制、血凝性、抗原性、宿主范圍和致病性；VP2蛋白還能自我組裝形成空衣殼。本課題主要對MEV VP2蛋白中參與調(diào)控病毒復(fù)制和宿主范圍的關(guān)鍵氨基酸位點進(jìn)行研究。首先,從發(fā)病水貂糞便樣品中分離出一株MEV毒株,通過PCR鑒定、F81細(xì)胞分離培養(yǎng)、電鏡觀察、血凝和血凝抑制、間接免疫熒光(IFA)和動物感染等實驗方法,證明分離株為一株MEV致病株,命名為MEV-LHV。IFA結(jié)果表明,致病株MEV-LHV的感染效率比本實驗室已分離的弱毒株MEV-L高。MEV-LHV和MEV-L的多步生長曲線結(jié)果表明,致病株MEV-LHV具有更強的復(fù)制能力,其最高滴度是弱毒株MEV-L的10倍。PCR擴增獲得了包括兩端發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列的MEV-LHV全基因組序列,并對發(fā)夾結(jié)構(gòu)及其功能元件進(jìn)行了預(yù)測。將MEV-LHV和MEV-L的全基因組序列與GenBank上的其它6株全基因組序列進(jìn)行了同源比對分析和進(jìn)化樹分析,更全面的了解了MEV全基因組特征和進(jìn)化特性,推測了可能與病毒復(fù)制和致病性相關(guān)的位點。上述研究中發(fā)現(xiàn)致病株比弱毒株具有更高的復(fù)制能力和致病性。為了探究VP2蛋白上可能與病毒復(fù)制和致病性有關(guān)的氨基酸,對GenBank中20株MEV毒株(包括MEV-LHV和MEV-L)的VP2序列進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)強弱毒株間有3個氨基酸位點存在差異,即101、232和411。以本實驗室已構(gòu)建的MEV-L全基因組感染性克隆pMEV-L為模板,利用PCR介導(dǎo)的定點突變技術(shù),分別將101 Ile、232 Ile和411 Ala突變成強毒株的相應(yīng)氨基酸101 Thr、232 Val和411 Glu,除了3個單位點突變的感染性克隆,還構(gòu)建了3個位點都突變的感染性克隆。共4個全基因組感染性克隆轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞病變、IFA等鑒定,證實4個突變體病毒拯救成功。各位點突變不影響病毒對宿主細(xì)胞的結(jié)合及進(jìn)入能力。病毒VP2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平、多步生長曲線、蝕斑實驗和單次感染周期內(nèi)病毒基因組DNA復(fù)制的檢測等結(jié)果表明,101和411位氨基酸突變能夠提高病毒的復(fù)制效率,但依然比致病株MEV-LHV的復(fù)制效率低；232位氨基酸的突變則降低了病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制效率,三突變體病毒(MEV-L I101T/I232V/A411E)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平最低；MEV-LHV與MEV-L轉(zhuǎn)錄水平無差異,但MEV-LHV的VP2蛋白表達(dá)水平更高,具有更高效的復(fù)制效率。對感染性病毒粒子的產(chǎn)生進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,與親本毒MEV-L相比,MEV-L I101T和MEV-L A411E不影響感染性病毒粒子的產(chǎn)生；而232位突變(MEV-L I232V和MEV-L I101T/I232V/A411E)則降低了感染性病毒粒子的產(chǎn)生；致病株MEV-LHV產(chǎn)生較高滴度的感染性病毒粒子。突變毒株分別接種水貂,并未產(chǎn)生明顯臨床癥狀,結(jié)果表明,這3個位點并不是致病力的決定因子。病毒與宿主細(xì)胞的識別與結(jié)合對病毒的致病性發(fā)揮關(guān)鍵作用。MEV不能感染犬腎細(xì)胞MDCK,而能感染表達(dá)貓源轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的MDCK細(xì)胞,證明MEV可以利用貓TfR作為受體感染細(xì)胞。MEV和犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus, CPV)是FPV的宿主變異株,對兩者的VP2蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對分析,發(fā)現(xiàn)6個差異的氨基酸位點80、93、103、323、564、568。將MEV-L的這6個氨基酸突變成CPV的相應(yīng)氨基酸,構(gòu)建了6個單位點突變的感染性克隆,以及93、323同時突變和80、564和568同時突變的2個感染性克隆。將上述8個感染性克隆分別轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞病變、IFA等鑒定,證實8個突變體病毒拯救成功。將MEV 93 Lys和323Asp分別突變成CPV的93 Asn和323 Asn,能夠使MEV感染MDCK,兩位點同時突變則感染效率更高,證明了93、323位氨基酸突變可使其宿主范圍擴大至犬細(xì)胞,且其突變不影響病毒與F81細(xì)胞受體的結(jié)合及細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制能力。將MEV80Lys、564 Asn和568 Ala分別突變?yōu)镃PV的80Arg、564 Ser和568 Gly,不影響病毒與細(xì)胞的結(jié)合能力,但3位點同時突變,則降低了病毒與F81細(xì)胞的結(jié)合效率,說明80、564、568位氨基酸同時突變,在一定程度上影響了病毒與宿主細(xì)胞受體的相互作用,但并不能抑制病毒感染F81細(xì)胞。80、564和568位氨基酸的單突變體或三突變體病毒均降低了病毒的復(fù)制效率。MEV V103A氨基酸突變對病毒的宿主范圍和復(fù)制效率無顯著影響。目前,隨著新的細(xì)小病毒的發(fā)現(xiàn),細(xì)小病毒宿主范圍不斷擴大。以上結(jié)果將有利于更全面的了解病毒的全基因組特征和生物學(xué)特征,為病毒復(fù)制、宿主范圍和致病性的深入研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1766457