發(fā)布時(shí)間：2018-04-16 01:17

  本文選題：莧菜 + 甜菜紅素　； 參考：《福建農(nóng)林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：甜菜紅素是一種吲哚來(lái)源的天然植物色素,具有抗氧化、抗癌等生理功能,廣泛存在于不含花青素的部分石竹目部分植物中。莧菜富含甜菜紅素,有取代甜菜作為甜菜紅素主要來(lái)源的趨勢(shì)。盡管參與甜菜紅素合成途徑中一些關(guān)鍵基因和多數(shù)關(guān)鍵酶已經(jīng)在甜菜等作物中被發(fā)現(xiàn),但甜菜色素合成機(jī)制仍未被完全揭示,而且莧菜中參與甜菜紅素合成的關(guān)鍵基因和關(guān)鍵酶也大多未見(jiàn)報(bào)道。因此,研究莧菜甜菜紅素合成機(jī)制可以進(jìn)一步完善甜菜紅素代謝通路,也為更好利用莧菜資源提供理論依據(jù)。本文以葉用莧菜為材料,進(jìn)行了甜菜紅素合成途徑關(guān)鍵基因的克隆,克隆到3條糖基轉(zhuǎn)移酶基因、1條AmaTyDC基因和1條AmaDODA基因的cDNA序列和gDNA序列,并克隆了AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT基因的啟動(dòng)子序列。研究了這些基因在莧菜不同品種間、不同組織部位及在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和不同光質(zhì)處理后的表達(dá)情況,并進(jìn)一步分析了這些基因的表達(dá)與莧菜中甜菜紅素含量的關(guān)系。以紅莧品種‘大紅’莧菜為材料,對(duì)葉片的紅色部分和綠色部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,揭示影響甜菜紅素合成的相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)及可能的影響因素,結(jié)合紅色葉片和綠色葉片的生理生化指標(biāo)系統(tǒng)地分析了莧菜葉片紅綠部分呈色的分子機(jī)理。1莧菜甜菜紅素合成相關(guān)基因及啟動(dòng)子克隆與分析利用RT-PCR和RACE技術(shù)成功從‘大紅’莧菜中克隆了3條糖基轉(zhuǎn)移酶基因：AmaDOPA5-GT(GenBank登錄號(hào)為：kp174811,長(zhǎng)度為1,700 bp)、AmaB6-GT(GenBank登錄號(hào)為：kp174812,長(zhǎng)度為1,674 bp)、AmaB5-GT(GenBank登錄號(hào)為：kp174810,長(zhǎng)度為1,666 bp),1條多巴脫羧酶基因AmaTyDC (GenBank登錄號(hào)為：Kp165397,長(zhǎng)度為1,669bp)和1條雙加氧酶基因AmaDODA(GenBank登錄號(hào)為：kp165399,長(zhǎng)度為1,085 bp) cDNA序列。并獲得了這5條基因的gDNA序列,其中只有AmaDODA具有2個(gè)內(nèi)含子,其它4條不具有內(nèi)含子。并進(jìn)一步對(duì)AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了克隆,通過(guò)對(duì)其順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),它們均含有豐富的響應(yīng)光、激素、厭氧、干旱及其它脅迫順式作用元件以及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),推測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)可能受光、激素、逆境脅迫以及MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。2莧菜甜菜色素含量與合成相關(guān)基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)分析2.1不同莧菜品種、不同組織部位中甜菜紅素含量和合成相關(guān)基因的表達(dá)情況研究不同莧菜品種中甜菜紅素含量差異較大,全紅莧菜甜菜紅素含量最高,綠莧中含量較少。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,AmaB6-GT, AmaB5-GT, AmaDOPA5-GT和AmaTyDC四條基因均在紅莧菜中表達(dá)量最高,AmaTyDC和AmaB6-GT在各莧菜品種中的表達(dá)量與它們含有的甜菜紅素趨勢(shì)一致,推測(cè)它們直接參與甜菜紅素合成的調(diào)控；AmaDODA基因在四個(gè)莧菜品種中的表達(dá)量差異不大,這可能與其參與其它代謝有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)AmaB5-GT, AmaB6-GT, AmaDOPA5-GT在‘大紅’莧菜各組織器官中的表達(dá)分析,結(jié)果表明它們分別在葉柄、葉、根和綠葉部分表達(dá)量最高,這與甜菜紅素含量：紅色葉片綠色葉片紅莖根綠莖和葉柄含量的差異趨勢(shì)不一致。2.2不同激素處理對(duì)莧菜甜菜紅素累積與相關(guān)基因表達(dá)量的影響細(xì)胞分裂素(KT和6-BA)處理可提高莧菜幼苗中甜菜紅素含量。其中KT通過(guò)誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)而提高莧菜幼苗中甜菜紅素的含量；而6-BA促進(jìn)AmaDODA和AmaB5-GT的表達(dá),6-BA通過(guò)提高多巴雙加氧酶的活性,增加了AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT可以催化生成莧菜苷的底物,從而促進(jìn)了莧菜中甜菜紅素的累積。而外源GA3和2,4-D抑制色素的累積。2,4-D處理的幼苗中,AmaB5-GT, AmaTyDC和AmaB6-GT的表達(dá)量與色素含量一致的降低。GA3具有轉(zhuǎn)移甜菜紅素合成前體物的作用,所以其它相關(guān)合成的基因表達(dá)水平高并不能使莧菜中累積較多的甜菜紅素。2.3不同光質(zhì)處理對(duì)莧菜甜菜紅素累積與相關(guān)基因表達(dá)量的影響對(duì)不同光質(zhì)處理?xiàng)l件下莧菜幼苗中甜菜紅素含量的變化的研究表明短波長(zhǎng)光質(zhì)(藍(lán)光)有利于色素的累積,這與莧菜幼苗中AmaTyDC, AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT三個(gè)基因的表達(dá)量一致,說(shuō)明這3個(gè)基因表達(dá)對(duì)甜菜紅素的合成影響較大。然而這3個(gè)基因與AmaDODA在紅光照射下表達(dá)量也較高,可能與莧菜幼苗中莧菜苷含量減少引起的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。3甜菜紅素分布及甜菜紅素含量不同的莧菜品種、組織部位生理生化指標(biāo)差異研究3.1甜菜紅素分布和淀粉含量研究徒手切片法對(duì)甜菜紅素在‘大紅’莧菜和‘白圓葉’莧菜不同組織部位的分布情況的研究表明：甜菜紅素在‘大紅’莧菜中主要分布在葉片背面靠近葉脈的表皮細(xì)胞及各組織部位的維管束周?chē)�的鞘�?xì)胞中,在‘白圓葉’莧菜的各組織部位觀察不到甜菜紅素的存在。另外,在‘白圓葉’莧菜的葉片中淀粉粒數(shù)量明顯多于‘大紅’莧菜,同時(shí)在‘大紅’莧菜中僅在靠近葉脈部位發(fā)現(xiàn)較多的淀粉粒。3.2紅葉和綠葉部分光合速率、抗氧化能力、葉綠素?zé)晒獠町愌芯糠謩e測(cè)定了‘大紅’莧菜紅葉部分和綠葉部分的光合速率。發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜葉片紅色部分凈光合速率明顯低于綠色部分。研究了‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分抗氧化能力差異,發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜紅色部分比綠色部分具有更高的SOD酶活性和總抗氧化能力。說(shuō)明了甜菜紅素具有清除植物體內(nèi)羥自由基和活性氧的能力。研究了室溫條件(25℃)和高溫處理(40℃)下,‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分葉綠素?zé)晒獠町惽闆r,發(fā)現(xiàn)在室溫條件(25℃)下,綠葉部分光合能力明顯高于紅葉部分,而在高溫(40℃)處理后,莧菜葉片紅色部分光合能力的降低水平明顯低于綠葉部分,說(shuō)明甜菜紅素對(duì)莧菜具抗熱脅迫作用。4莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉(zhuǎn)錄組差異分析利用RNA-Seq技術(shù)比較分析了‘大紅’莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉(zhuǎn)錄組差異,獲得80,026條莧菜Unigene,其中2,178條unigene(1,320條上調(diào),858條下調(diào))在紅綠葉樣品間表達(dá)差異顯著。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行功能歸類分析發(fā)現(xiàn)：這些基因主要涉及次級(jí)代謝、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、光合作用、淀粉和糖代謝等途徑。這些基因的差異表達(dá)在一定程度上驗(yàn)證了我們?cè)谇捌讷@得的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝相關(guān)基因在紅色葉片中下調(diào)顯著,這印證了甜菜紅素合成和類黃酮在植物中的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,也可以在一定程度上解釋甜菜紅素和花青素“不共存”現(xiàn)象。另外,一些MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因在紅綠葉部分差異表達(dá)極顯著,其中有三個(gè)在紅葉部分極顯著上調(diào)的MYB基因與甜菜BvMYB1基因同源性較高,推測(cè)它們可能在調(diào)控莧菜甜菜紅素合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)了大量的未知功能的差異表達(dá)基因,說(shuō)明莧菜中甜菜紅素代謝的調(diào)控可能還有很多不明之處,仍需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S636.4
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本文編號(hào)：1756664