發(fā)布時間：2018-04-13 02:12

  本文選題：FcRn + IgG　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：大約95%以上病原微生物都是通過黏膜途徑入侵機體的,因此黏膜免疫日益受到人們的重視。一般認為黏膜免疫主要是通過多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)介導(dǎo)IgA轉(zhuǎn)運到黏膜表面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn),在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG,并在黏膜表面保護機體防止病原入侵的過程中起到重要作用。而IgG轉(zhuǎn)運到黏膜表面主要是通過新生兒Fc受體(neonatal Fc receptor,FcRn)介導(dǎo)的。目前大量的研究主要集中在對人和小鼠的FcRn功能及表達調(diào)控方面的研究,但是對于豬源的FcRn功能的研究比較少,同時國內(nèi)外尚未見到有關(guān)病原感染對FcRn表達調(diào)控方面的研究。因此,本研究擬應(yīng)用豬小腸上皮細胞系(IPEC-J2)構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型,研究豬FcRn介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運功能;同時研究豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染IPEC-J2細胞激活NF-κB信號通路對FcRn的表達調(diào)控。取得的主要研究結(jié)果如下:1.豬小腸上皮細胞FcRn的表達及分布根據(jù)已經(jīng)報道的豬FcRnα鏈基因序列設(shè)計特異性引物,以IPEC-J2細胞的總RNA為模板,利用RT-PCR方法擴增獲得了FcRnα鏈基因片段。經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)FcRn蛋白在IPEC-J2細胞系上的表達。進一步通過間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)FcRn主要分布在極化的IPEC-J2細胞的頂膜側(cè);仔豬空腸組織切片檢測結(jié)果也顯示FcRn主要分布在小腸絨毛上皮細胞的頂膜側(cè)。2.豬FcRn介導(dǎo)IgG雙向胞轉(zhuǎn)作用的研究以IPEC-J2細胞構(gòu)建體外胞轉(zhuǎn)模型,將生物素標記的豬IgG(biotin-IgG)加入到胞轉(zhuǎn)模型,進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)極化的IPEC-J2細胞在37°C可以雙向轉(zhuǎn)運IgG,在4°C不能轉(zhuǎn)運IgG。以上結(jié)果證明IgG是跨細胞途徑轉(zhuǎn)運穿過上皮細胞屏障。為了進一步研究IgG跨極化上皮細胞雙向轉(zhuǎn)運是由FcRn特異性介導(dǎo)的,在biotin-IgG胞轉(zhuǎn)過程中加入protein A或未標記的IgG作為抑制劑。結(jié)果顯示在加入protein A或未標記的IgG后,明顯抑制了IgG雙向轉(zhuǎn)運。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果也證明了FcRn可以與IgG在細胞內(nèi)結(jié)合并介導(dǎo)Ig G跨上皮細胞轉(zhuǎn)運。運用免疫共沉淀的方法證明了FcRn與IgG結(jié)合是pH依賴的,即在酸性條件下pH6.5,FcRn與IgG結(jié)合,在中性偏堿性條件下pH7.0,FcRn與IgG不結(jié)合。由于FcRn可以介導(dǎo)IgG的轉(zhuǎn)運,因此,在胞轉(zhuǎn)模型中,以TGEV為模式病原,將抗TGEV特異性IgG加入到細胞底側(cè)小室,在極化的IPEC-J2細胞頂側(cè)小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FcRn轉(zhuǎn)運特異性IgG能夠中和病毒。以上結(jié)果說明Fc Rn介導(dǎo)IgG轉(zhuǎn)運穿過黏膜屏障,在保護機體防止病原通過黏膜表面入侵的過程中起到重要作用。3.TGEV感染IPEC-J2細胞激活NF-κB信號通路對FcRn表達調(diào)控的研究NF-κB是一個廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子,主要涉及與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。本研究發(fā)現(xiàn)TGEV感染IPEC-J2細胞能夠激活NF-κB信號通路。首先,運用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TGEV感染IPEC-J2細胞對NF-κB的激活情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)能顯著增強NF-κB熒光素酶活性。進一步通過pEGFP-p65質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞,在TGEV感染后,激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示p65轉(zhuǎn)位入核。TGEV感染IPEC-J2細胞,通過熒光定量PCR和Western blot方法檢測發(fā)現(xiàn)能顯著上調(diào)FcRn的表達。經(jīng)在線軟件分析FcRn啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)除了具有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點還有MAPK下游的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,因此為了確定NF-κB和MAPK在FcRn上調(diào)表達中的作用,應(yīng)用NF-κB抑制劑和MAPK相關(guān)抑制劑處理細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑處理的細胞能顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達,而MAPK抑制劑處理的細胞不影響TGEV誘導(dǎo)的FcRn表達。說明FcRn的上調(diào)表達與NF-κB信號通路密切相關(guān)。進一步根據(jù)在線軟件預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點將FcRn啟動子區(qū)域不斷截短,最終構(gòu)建了9個不同長度的FcRn啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒,經(jīng)熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)FcRn啟動子區(qū)NF-κB主要結(jié)合位點位于上游的-1381~-208之間。最后應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)和凝膠遷移實驗(EMSA)證明這個區(qū)域具有4個p65轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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本文編號：1742468