發(fā)布時(shí)間：2017-12-12 09:06

  本文關(guān)鍵詞：乳酸菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦益生機(jī)理的研究

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【摘要】：從商業(yè)益生菌產(chǎn)品、中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)和矛尾蝦虎魚(Acanthogobius hasta)的腸道中共分離得到53株乳酸菌,并對(duì)這些菌株進(jìn)行了溶血活性、抑菌性和粘附性的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,53株乳酸菌均沒(méi)有溶血活性,有兩株菌在所篩選得到的菌株中分別表現(xiàn)出了較好的抑菌性和粘附性�；�于16S rRNA分子生物學(xué)鑒定和生理生化實(shí)驗(yàn),確定以上兩株菌分別為戊糖乳桿菌HC-2和糞腸球菌NRW-2。探討和比較了HC-2、NRW-2和HC-2發(fā)酵上清液對(duì)凡納濱對(duì)蝦的益生作用及其益生機(jī)理。首先,在基礎(chǔ)飼料中分別添加HC-2、NRW-2、HC-2的發(fā)酵上清液,最終每克基礎(chǔ)飼料中含有1.0×107 CFU益生菌或此菌量所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵上清液,共配制3組實(shí)驗(yàn)飼料,進(jìn)行為期四周的投喂實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明凡納濱對(duì)蝦投喂含有HC-2或NRW-2的飼料時(shí),其特定生長(zhǎng)率高于對(duì)照組;而投喂HC-2發(fā)酵上清液時(shí),其特定生長(zhǎng)率低于對(duì)照組但是差異不顯著。同時(shí),利用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定了對(duì)蝦中腸和肝胰腺中相關(guān)免疫基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加NRW-2兩周和四周時(shí)顯著促進(jìn)了凡納濱對(duì)蝦中腸中PEN-3α、proPO和lysozyme的表達(dá);而HC-2及其發(fā)酵上清液對(duì)肝胰腺中相關(guān)免疫基因的表達(dá)具有較高的誘導(dǎo)作用。此外攻毒實(shí)驗(yàn)顯示所有處理組中凡納濱對(duì)蝦對(duì)病原菌的抵抗力均顯著高于對(duì)照組。其次,研究了飼料中添加益生菌及其發(fā)酵上清液對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和腸道消化酶活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦腸道中蛋白酶活力顯著提高(P0.05),但肝胰腺中蛋白酶活力無(wú)顯著差異;添加NRW-2的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,腸道和肝胰腺中淀粉酶和脂肪酶活力均顯著提高(P0.05),HC-2組對(duì)蝦肝胰腺中淀粉酶及腸道中脂肪酶的活力顯著提高(P0.05),而HC-2發(fā)酵上清液的添加僅顯著提高了對(duì)蝦腸道蛋白酶和淀粉酶的活性。結(jié)果表明,飼料中添加NRW-2、HC-2及其發(fā)酵上清液可以提高凡納濱對(duì)蝦腸道及肝胰腺中消化酶的活力,但在不同組織中提高消化酶活性的種類是不同的。此外,利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析了凡納濱對(duì)蝦腸道中的細(xì)菌組成。高通量數(shù)據(jù)顯示Proteobacteria,Verrucomicrobia和Actinobacteria是各個(gè)處理組中的優(yōu)勢(shì)菌群,但各個(gè)處理組中均存在其特有的細(xì)菌種類,并且飼料中添加HC-2發(fā)酵上清液后,與對(duì)照組相比,顯著增加了對(duì)蝦腸道中Actinobacteria的豐度。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,益生菌及其發(fā)酵上清液的添加改變了對(duì)蝦腸道細(xì)菌的組成及其豐富。但是不同實(shí)驗(yàn)飼料的投喂沒(méi)有明顯改善對(duì)蝦腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu),由此推測(cè)對(duì)蝦腸道中微生物群落之間復(fù)雜的相互作用或許在保持或促進(jìn)對(duì)蝦健康方面發(fā)揮著重要的作用。再次,為了探討HC-2和副溶血弧菌E1(VPE1)在對(duì)蝦體內(nèi)外的相互作用,利用DAPI和CFDA-SE分別對(duì)HC-2和VPE1進(jìn)行熒光標(biāo)記后,用熒光顯微鏡觀察兩株菌在對(duì)蝦腸道中的分布情況。當(dāng)對(duì)蝦同時(shí)投喂這兩株菌時(shí),在對(duì)蝦腸道內(nèi)HC-2對(duì)VPE1具有一定的競(jìng)爭(zhēng)排斥作用。此外,在體外跟蹤測(cè)定了HC-2與VPE1共培養(yǎng)或者純培養(yǎng)時(shí)兩株菌的生長(zhǎng)情況和菌中與群體感應(yīng)或毒力因子相關(guān)的免疫基因的表達(dá)。結(jié)果得知,HC-2與VPE1共培養(yǎng)8小時(shí)后,培養(yǎng)液中VPE1的菌濃度顯著下降而HC-2的菌濃度變化趨勢(shì)與純培養(yǎng)時(shí)相一致。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示,共培養(yǎng)8小時(shí)后,HC-2中l(wèi)uxS基因的表達(dá)量逐漸上升,說(shuō)明LuxS或許參與到HC-2對(duì)VPE1的競(jìng)爭(zhēng)排斥過(guò)程。有趣的是,熱失活的HC-2菌體可以顯著促進(jìn)VPE1中的aphA、opaR和tlh的表達(dá),該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HC-2的胞內(nèi)成分在共培養(yǎng)時(shí)可以促進(jìn)VPE1毒力相關(guān)因子的短期表達(dá),這或許會(huì)增加對(duì)蝦感染弧菌的風(fēng)險(xiǎn)。最后,探討了戊糖乳桿菌HC-2在凡納濱對(duì)蝦感染弧菌前后的短期投喂對(duì)凡納濱對(duì)蝦存活率和腸道中相關(guān)免疫基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,凡納濱對(duì)蝦投喂益生菌后再浸浴在弧菌中的存活率高于對(duì)蝦感染弧菌后再投喂益生菌的存活率,但是差異不顯著。并且對(duì)蝦腸道相關(guān)免疫基因的表達(dá)情況也說(shuō)明,當(dāng)凡納濱對(duì)蝦受到弧菌的感染后,益生菌的添加對(duì)凡納濱對(duì)蝦內(nèi)在免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用,在一定程度上可以增強(qiáng)其對(duì)病原菌的抵抗力,但益生菌的短期投喂不能較好的提高凡納濱對(duì)蝦抵抗病原菌的能力。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S968.22

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本文編號(hào)：1281913