發(fā)布時間：2017-12-11 13:28

  本文關鍵詞：抗停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的表位疫苗構(gòu)建及免疫原性評價

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【摘要】：奶牛乳房炎主要是由病原微生物引起的奶牛乳腺炎癥,給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。引起奶牛乳房炎的病原菌眾多,其中以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和鏈球菌引起的奶牛乳房炎最為常見。目前,臨床抗生素療法無法控制金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染,疫苗研制迫在眉睫。研究證明,在預防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染過程中細胞免疫應答發(fā)揮主要作用,尤其在預防金黃色葡萄球菌感染中以Th1和Th17細胞免疫應答為主,因而啟動CD4~+T細胞應答對于設計有效預防奶牛乳房炎疫苗至關重要�？乖�誘導免疫應答發(fā)揮關鍵作用的部分是抗原表位,因此構(gòu)建能夠啟動CD4~+T細胞并誘導分化為Th1/Th7類型免疫應答的表位疫苗可能會有效預防鏈球菌和金黃色葡萄球菌的感染。停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae,S.dysgalactiae)GapC和金黃色葡萄球菌TRAP蛋白能夠誘導特異性細胞免疫應答且高度保守,而GapC和TRAP的CD4~+T細胞表位未見報道,對于包含停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的CD4~+T細胞表位和B細胞表位的表位疫苗也未見報道。因此,本研究首先對GapC和TRAP的CD4~+T細胞免疫優(yōu)勢表位進行篩選,構(gòu)建涵蓋GapC和TRAP的免疫優(yōu)勢CD4~+T細胞表位和B細胞表位的多表位疫苗,以期獲得一種能夠同時有效預防鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染的新型疫苗。本研究通過預測GapC和TRAP蛋白與MHCⅡ的親和力,結(jié)合目標蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及其保守序列分析篩選并分別合成6個GapC(15-mer)和5個TRAP(20-mer)的候選表位肽,分別以候選表位刺激免疫蛋白或表位的BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠的CD4~+T細胞,檢測CD4~+T細胞增殖水平和細胞因子分泌水平,并對鑒定表位的保守性進行分析。結(jié)果顯示:GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)能夠誘導特異性的CD4~+T細胞增值,同時分泌了高水平的IFN-γ和IL-17A,與PBS免疫組之間存在極顯著差異,表明鑒定的表位主要引起Th1和Th17型免疫反應,證實GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP(94-113)分別為GapC和TRAP的CD4~+T細胞表位,且鑒定表位高度保守。在上述研究基礎上,將獲得的CD4~+T細胞表位GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)分別與實驗室前期鑒定的B細胞表位GapC_(30-36)、GapC_(48-57)、GapC_(97-103)和TRAP_(154-163)進行串聯(lián),并將氨基酸序列對應的目標基因進行合成,將目標基因插入pET32a載體中,構(gòu)建含有多個表位的重組質(zhì)粒,誘導表達并純化重組蛋白,制備重組表位疫苗PT、PG和PTG。將構(gòu)建的表位疫苗免疫BALB/c和C57BL/6小鼠后進行免疫原性分析。通過淋巴細胞增殖試驗、細胞因子的檢測評價表位疫苗的細胞免疫效果;通過抗體水平檢測、調(diào)理吞噬試驗評價表位疫苗的體液免疫效果;通過攻毒試驗評價表位疫苗的免疫保護效果。結(jié)果顯示:表位疫苗PT、PG和PTG能夠誘導特異性的淋巴細胞增值,同時,特異性淋巴細胞分泌的細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A水平顯著高于pET32a對照組,說明表位疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生特異性的細胞免疫應答;表位疫苗PT、PG和PTG產(chǎn)生的抗TRAP和GapC的IgG抗體水平顯著高于pET32a對照組,且特異性抗體對于停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌具有一定的調(diào)理吞噬作用,說明表位疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫應答;攻毒實驗結(jié)果顯示表位疫苗PT、PG和PTG具有良好的免疫保護效果,其中表位疫苗PT能夠較好的抑制金黃色葡萄球菌感染,而PG能夠部分抑制停乳鏈球菌感染,PTG能夠部分抑制停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的感染。上述結(jié)果表明,構(gòu)建的表位疫苗使包含的CD4~+T細胞表位及B細胞表位各自發(fā)揮功能,可為奶牛乳房炎疫苗的深入研究提供參考。
【學位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23

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本文編號：1278640