人iPSCs分化成視網(wǎng)膜類器官的在體移植及生物力學(xué)研究
發(fā)布時(shí)間：2020-12-07 15:44
視網(wǎng)膜變性（Retina degeneration,RD）相關(guān)疾病可導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞逐漸丟失,進(jìn)而發(fā)生視功能障礙甚至致盲。目前視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的細(xì)胞替代治療是較有前景的研究方向,但仍需尋找合適來源的移植細(xì)胞和移植手段。為了探究人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human-induced pluripotentstemcells,hiPSCs）體外向視網(wǎng)膜類器官（Retinaorganoids,ROs）的分化進(jìn)程并進(jìn)行在體細(xì)胞移植的嘗試,我們采用3D培養(yǎng)方法,獲得具有典型視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的ROs。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和免疫熒光染色,我們系統(tǒng)地鑒定誘導(dǎo)分化進(jìn)程及效果。形態(tài)學(xué)和組織染色結(jié)果證明,ROs可模擬人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育進(jìn)程和經(jīng)典分子標(biāo)記物的時(shí)空表達(dá)。我們將ROs在體移植至Gnat1-/-小鼠視網(wǎng)膜內(nèi),觀察其存活及整合情況。結(jié)果顯示,ROs細(xì)胞移植三周后,自身帶有綠色熒光的細(xì)胞成功在宿主小鼠的視網(wǎng)膜外核層中長(zhǎng)期存活,移植4-6月后植入細(xì)胞表達(dá)功能性光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白GNAT1。證實(shí)了移植的ROs細(xì)胞能在受體小鼠眼內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定存活,進(jìn)入外核層并進(jìn)一步發(fā)育成熟為類感光細(xì)胞。另外,在誘導(dǎo)分化前期貼壁培養(yǎng)集落的過程中,我們發(fā)...
【文章來源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：68 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１．２光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程示意圖??（Ｌａ?ｒｅｔｉｎａ，?ｌａ?ｆｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｃｉｏｎ，?Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?ｄｅ?Ｃｏｓｔａ?Ｒｉｃａ）??（２）視覺循環(huán)：光異構(gòu)化將１１－順式視黃醛轉(zhuǎn)化為外段中的所有反式視黃??“”
內(nèi)的具體位置。根據(jù)細(xì)胞的功能不同，有些細(xì)胞更容易受到一些壓??力的影響。事實(shí)上，不僅僅是高度特化的細(xì)胞，如參與聽力的毛細(xì)胞，或觸摸敏??感的神經(jīng)元能夠感覺這些刺激，其實(shí)每個(gè)細(xì)胞都有感覺和響應(yīng)機(jī)械壓力的能力。??應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）從全身系統(tǒng)傳遞到器官、組織??和細(xì)胞。應(yīng)力傳遞到細(xì)胞水平的程度在很大程度上取決于細(xì)胞周邊的機(jī)械行為、??細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞本身的相對(duì)物質(zhì)屬性。作用在細(xì)胞上的三種基本的機(jī)械應(yīng)力是??拉力、壓縮力和剪切力［１２５］（圖１．３）。??Ｓｈｅａｒ??＾?Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ??Ｔｅｎｓｉｏｎ??圖１．３細(xì)胞水平的機(jī)械應(yīng)力作用??（Ｓｐａｓｉｃ?Ｍ，?ｅｔ?ａｌ．．?Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ?Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，?２０１１）??機(jī)械應(yīng)力傳遞到細(xì)胞水平，產(chǎn)生的力的大小和位置取決于機(jī)械環(huán)境和細(xì)胞的??機(jī)械性能。細(xì)胞可以免受壓力，或者相反，壓力可以集中在特定的位置。細(xì)胞具??有機(jī)械感覺能力，能夠?qū)C(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換成生化反應(yīng)。有多種不同的機(jī)械信號(hào)作用??于細(xì)胞，有多種蛋白參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，反應(yīng)范圍從細(xì)胞骨架排列的短期變化到基因??表達(dá)的長(zhǎng)期變化。通常，機(jī)械信號(hào)通過特化蛋白或蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，??協(xié)調(diào)的反應(yīng)使細(xì)胞適應(yīng)不斷變化的機(jī)械條件，進(jìn)而調(diào)節(jié)組織形態(tài)和重塑。??１２??
?第３章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論???第３章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論??３．１．?ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)及自組裝分化??ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞首先在包被Ｇｅｌｔｒｅｘ的孔板里貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞呈多角形或梭??形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜清晰可見并穩(wěn)定表達(dá)綠色突光蛋白（Ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），細(xì)胞核呈橢圓形，多位于細(xì)胞中央。培養(yǎng)５－７天后，貼壁培養(yǎng)的??單層細(xì)胞不斷分裂擴(kuò)增，成鑲嵌樣緊密排列長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞融合約９０％及以??上時(shí)，消化刮取的細(xì)胞團(tuán)塊呈不定形態(tài)，邊緣卷曲，透亮，大小約４５０ｐｍ為宜，??懸浮培養(yǎng)開始自組裝成神經(jīng)球。Ｄａｙ７神經(jīng)球大小為２２０±５〇ｎｍ，內(nèi)部呈灰黑色，??組織疏松，外層透亮且較為緊致（圖３．１）。??＠■１?ＥＨ??圖３．１顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞和神經(jīng)球自組裝過程（標(biāo)尺＝５０〇ｎｍ）??圖注：（Ａ）單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞呈多角形或梭形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜清晰可見。（Ｂ）??單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)ＧＦＰ。（Ｃ）細(xì)胞增殖大量融合時(shí)酶解，刮取并懸浮培養(yǎng)??的細(xì)胞團(tuán)塊，大小約為４５〇ｎｍ。（Ｄ）Ｄａｙ７細(xì)胞團(tuán)塊自組裝成大小為２２０±５〇ｎｍ的??神經(jīng)球，內(nèi)部呈灰黑色，組織疏松，外層透亮且緊致。??２９??
本文編號(hào)：2903516
【文章來源】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：68 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１．２光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程示意圖??（Ｌａ?ｒｅｔｉｎａ，?ｌａ?ｆｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｃｉｏｎ，?Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?ｄｅ?Ｃｏｓｔａ?Ｒｉｃａ）??（２）視覺循環(huán)：光異構(gòu)化將１１－順式視黃醛轉(zhuǎn)化為外段中的所有反式視黃??“”
內(nèi)的具體位置。根據(jù)細(xì)胞的功能不同，有些細(xì)胞更容易受到一些壓??力的影響。事實(shí)上，不僅僅是高度特化的細(xì)胞，如參與聽力的毛細(xì)胞，或觸摸敏??感的神經(jīng)元能夠感覺這些刺激，其實(shí)每個(gè)細(xì)胞都有感覺和響應(yīng)機(jī)械壓力的能力。??應(yīng)力通過細(xì)胞外基質(zhì)（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）從全身系統(tǒng)傳遞到器官、組織??和細(xì)胞。應(yīng)力傳遞到細(xì)胞水平的程度在很大程度上取決于細(xì)胞周邊的機(jī)械行為、??細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞本身的相對(duì)物質(zhì)屬性。作用在細(xì)胞上的三種基本的機(jī)械應(yīng)力是??拉力、壓縮力和剪切力［１２５］（圖１．３）。??Ｓｈｅａｒ??＾?Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ??Ｔｅｎｓｉｏｎ??圖１．３細(xì)胞水平的機(jī)械應(yīng)力作用??（Ｓｐａｓｉｃ?Ｍ，?ｅｔ?ａｌ．．?Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ?Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，?２０１１）??機(jī)械應(yīng)力傳遞到細(xì)胞水平，產(chǎn)生的力的大小和位置取決于機(jī)械環(huán)境和細(xì)胞的??機(jī)械性能。細(xì)胞可以免受壓力，或者相反，壓力可以集中在特定的位置。細(xì)胞具??有機(jī)械感覺能力，能夠?qū)C(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)換成生化反應(yīng)。有多種不同的機(jī)械信號(hào)作用??于細(xì)胞，有多種蛋白參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，反應(yīng)范圍從細(xì)胞骨架排列的短期變化到基因??表達(dá)的長(zhǎng)期變化。通常，機(jī)械信號(hào)通過特化蛋白或蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)，??協(xié)調(diào)的反應(yīng)使細(xì)胞適應(yīng)不斷變化的機(jī)械條件，進(jìn)而調(diào)節(jié)組織形態(tài)和重塑。??１２??
?第３章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論???第３章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論??３．１．?ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)及自組裝分化??ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞首先在包被Ｇｅｌｔｒｅｘ的孔板里貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞呈多角形或梭??形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜清晰可見并穩(wěn)定表達(dá)綠色突光蛋白（Ｇｒｅｅｎ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），細(xì)胞核呈橢圓形，多位于細(xì)胞中央。培養(yǎng)５－７天后，貼壁培養(yǎng)的??單層細(xì)胞不斷分裂擴(kuò)增，成鑲嵌樣緊密排列長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞融合約９０％及以??上時(shí)，消化刮取的細(xì)胞團(tuán)塊呈不定形態(tài)，邊緣卷曲，透亮，大小約４５０ｐｍ為宜，??懸浮培養(yǎng)開始自組裝成神經(jīng)球。Ｄａｙ７神經(jīng)球大小為２２０±５〇ｎｍ，內(nèi)部呈灰黑色，??組織疏松，外層透亮且較為緊致（圖３．１）。??＠■１?ＥＨ??圖３．１顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的ＢＣｌ－ｅＧＦＰ細(xì)胞和神經(jīng)球自組裝過程（標(biāo)尺＝５０〇ｎｍ）??圖注：（Ａ）單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞呈多角形或梭形，細(xì)胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜清晰可見。（Ｂ）??單層貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)ＧＦＰ。（Ｃ）細(xì)胞增殖大量融合時(shí)酶解，刮取并懸浮培養(yǎng)??的細(xì)胞團(tuán)塊，大小約為４５〇ｎｍ。（Ｄ）Ｄａｙ７細(xì)胞團(tuán)塊自組裝成大小為２２０±５〇ｎｍ的??神經(jīng)球，內(nèi)部呈灰黑色，組織疏松，外層透亮且緊致。??２９??
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