發(fā)布時間：2020-11-21 02:06

　　 目的:采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法建立白消安(busulfan,Bu)在Beagle犬體內(nèi)的定量測定方法,對白消安在Beagle犬體內(nèi)不同給藥途徑的藥動學特征進行評價;測定Beagle犬體內(nèi)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)活性,研究白消安和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)對GST活性的影響,并通過不同給藥組的藥動學數(shù)據(jù)以及GST活性,從而探討由GST介導的環(huán)磷酰胺對白消安藥動學的影響,為臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。方法:1.白消安在Beagle犬體內(nèi)定量測定方法的建立使用柱前衍生方法,對白消安進行衍生化處理,衍生化試劑為二乙基二硫代氨基甲酸鈉(sodium diethyldithiocarbamate,DDTC),內(nèi)標(internal standard,IS)選定為1,5-戊二醇二甲磺酸酯,色譜柱為Diamonsil(Ⅱ)C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),柱溫為30℃,流動相為甲醇-水(54:46),流速為1.0 mL·min~(-1),檢測波長為280 nm,進樣體積為25μL,從專屬性、標準曲線和定量下限、精密度和準確度、萃取回收率、穩(wěn)定性等方面進行方法學驗證,建立白消安體內(nèi)測定方法。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)靜脈注射和口服給藥的藥動學研究成年健康Beagle犬3只,進行雙周期交叉試驗。白消安以靜脈注射和口服兩種給藥途徑給藥,劑量分別為0.898 mg·kg~(-1)和1.5 mg·kg~(-1)。于犬一側(cè)前肢靜脈埋入留置針采血,血樣經(jīng)37℃水浴30 min,4000 r·min~(-1)離心10 min后得血清樣品。血清樣品經(jīng)蛋白沉淀和衍生化預處理后,進樣分析,測定白消安血藥濃度,采用非隔室模型,通過藥動學軟件DAS 3.2計算靜注和口服給藥的血藥濃度-時間曲線下面積(area under the curve,AUC),平均滯留時間(mean residence time,MRT),表觀分布容積(apparent volume of distribution,V),比較兩種給藥方式的藥動學特征。3.GST活性測定以及白消安和環(huán)磷酰胺對GST活性的影響成年健康Beagle犬3只,分別靜注白消安和口服環(huán)磷酰胺,進行雙周期交叉試驗。白消安靜注劑量為0.898 mg·kg~(-1),環(huán)磷酰胺口服劑量為14.96 mg·kg~(-1)。于給藥后1 h時采集血清樣品,使用紫外分分光度法測定樣本GST活性,分析兩種藥物分別對GST活性的影響。4.白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)用時的藥動學研究和GST活性測定成年健康Beagle犬3只,進行雙周期交叉試驗。給藥方案設(shè)置為Cy預處理給藥組和Bu/Cy同時給藥組。Cy預處理組具體給藥方案為連續(xù)4天口服環(huán)磷酰胺,并于第4天給藥環(huán)磷酰胺1 h后,靜注白消安;Bu/Cy同時組給藥方案為在30 s內(nèi)靜脈注射白消安和環(huán)磷酰胺。白消安靜注劑量為0.898 mg·kg~(-1)。按照非臨床藥代動力學采血時間設(shè)計原則,設(shè)置采血點,于犬一側(cè)前肢靜脈埋入留置針采血,血樣經(jīng)蛋白沉淀和衍生化后進樣分析,測定白消安血藥濃度,采用非隔室模型,通過藥動學軟件DAS3.2計算Cy預處理組和Bu/Cy同時組的藥動學參數(shù),分別與Bu單獨靜注組的藥動學參數(shù)進行比較。并且測定Cy預處理組和Bu/Cy同時組給藥后的GST活性,結(jié)合藥動學結(jié)果,分析環(huán)磷酰胺對白消安體內(nèi)代謝的影響。結(jié)果:1.白消安在Beagle犬體內(nèi)測定的方法學驗證經(jīng)HPLC進樣分析,白消安的保留時間為10.2 min,峰形明顯,分離較好,且不受血清其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾;標準曲線為Y=1.6015C-0.1353,R~2=0.9918,在0.1~3.5mg·L~(-1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;精密度與準確度、萃取回收率和穩(wěn)定性結(jié)果均符合方法學要求。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)靜注和口服給藥的藥動學結(jié)果白消安口服給藥在(1.00±0.50)h時可達最大吸收,峰濃度為(0.81±0.49)mg·L~(-1)。口服給藥的MRT為(2.37±0.84)h,低于靜注組的(1.31±0.07)h,提示白消安靜注時在體內(nèi)停留時間較口服時更短。3.白消安和環(huán)磷酰胺對體內(nèi)GST活性的影響利用紫外分光光度法分別測定白消安和環(huán)磷酰胺給藥前后GST活性,結(jié)果顯示白消安給藥前GST活性為(3.874±0.761)nmol?min~(-1)?mL~(-1),給藥后為(4.237±0.778)nmol?min~(-1)?mL~(-1),并無顯著性差異。環(huán)磷酰胺給藥前GST活性為(4.159±0.922)nmol?min~(-1)?mL~(-1),給藥后為(7.309±0.612)nmol?min~(-1)?mL~(-1),具有顯著性差異,表明環(huán)磷酰胺能夠誘導GST活性,而白消安對GST活性無明顯作用。4.白消安和環(huán)磷酰胺聯(lián)用時的藥動學及GST活性結(jié)果在Cy預處理給藥組中,AUC_(0-t)為(1.87±0.07)h·(mg·L~(-1)),相比Bu單獨靜注組減少了44.5%;MRT為(0.98±0.05)h,低于Bu單獨靜注組的MRT為(1.31±0.07)h。在Bu/Cy同時給藥組中,AUC_(0-t)為(1.66±0.14)h·(mg·L~(-1)),MRT為(0.96±0.08)h,均低于Bu單獨靜注組,兩試驗組數(shù)據(jù)與Bu單獨靜注組比較,均具有顯著性差異。提示白消安和環(huán)磷酰胺同時給藥后,白消安在體內(nèi)的消除速度是加快的。Cy預處理給藥組和Bu/Cy同時給藥組的GST活性均高于Bu單獨靜注組,表明環(huán)磷酰胺通過誘導GST,使其活性提高,從而導致白消安體內(nèi)代謝加快。結(jié)論:1.建立了白消安在Beagle犬體內(nèi)的HPLC測定方法,該方法準確可靠,靈敏度高且易于操作。2.白消安在Beagle犬體內(nèi)的藥動學結(jié)果顯示,白消安靜注時在體內(nèi)停留時間較口服時更短。3.確定環(huán)磷酰胺可以誘導體內(nèi)GST活性,而白消安無明顯作用;當兩種藥物同時存在時,受到環(huán)磷酰胺對于GST的誘導作用,白消安體內(nèi)消除加快。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文92結(jié)果2.1專屬性Beagle犬空白血清色譜圖見圖1-2A，空白血清+IS色譜圖見圖1-2B，空白血清+IS+白消安標準溶液的色譜圖見圖1-2C，含藥血清+IS色譜圖見圖1-2D。由圖可知，白消安的保留時間是10.2min，IS的保留時間是16.1min，二者峰形明顯，血清中的其他內(nèi)源性物質(zhì)不干擾白消安的測定。圖1-2白消安衍生化測定色譜圖A：空白血清；B：空白血清+IS；C：空白血清+IS+Bu；D：含藥血清+IS1：Bu衍生化物；2：IS衍生化物；3：DDTC

山西醫(yī)科大學碩士學位論文102.2標準曲線和定量下限如圖1-3所示，白消安在濃度為0.1~3.5mg·L-1的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。求得的標準曲線方程：Y=1.6015C-0.1353，R2=0.9918。使用該方法在HPLC上測得的Beagle犬血清中白消安濃度的定量下限為0.1mg·L-1，RSD=2.8%，n=6。圖1-3白消安在Beagle犬血清中測定的標準曲線2.3準確度和精密度準確度和精密度結(jié)果見表1-3，該分析方法的日內(nèi)和日間精密度在1.3%~8.3%之間，均小于15%，準確度在-1.0%~9.5%之間，符合生物樣品分析方法的要求。表1-3準確度和精密度（x±SD，n=6）Bu濃度（mg·L-1）日內(nèi)日間x±SDRSD(%)RE(%)x±SDRSD(%)RE(%)0.20.20±0.012.7-1.00.21±0.014.23.51.01.04±0.098.33.71.10±0.054.69.52.52.51±0.083.30.22.49±0.031.3-0.5

山西醫(yī)科大學碩士學位論文172結(jié)果2.1白消安單劑量靜注和單次口服的藥-時曲線Beagle犬靜脈注射和口服給藥的白消安藥-時曲線見圖2-1。由圖可知，Beagle犬靜注給藥時，血藥濃度隨時間而降低，在4h后低于定量下限�？诜�給予白消安時，犬No.1-No.3分別于6h、8h和4h血藥濃度低于定量下限，且個體間有較大的差異。圖2-1Bu單劑量靜注和單次口服給藥的藥-時曲線（n=3）A：Bu單劑量靜注的藥-時曲線；B：Bu單次口服的藥-時曲線2.2白消安單劑量靜注和單次口服的藥動學參數(shù)Beagle犬靜脈注射和口服給藥的白消安藥動學參數(shù)見表2-3。表2-3Bu單劑量靜注和單次口服的藥動學參數(shù)（x±SD，n=3）Bu單劑量靜注Bu單次口服AUC0-th·(mg·L-1)3.37±0.181.82±0.45AUC0-∞h·(mg·L-1)4.09±0.532.09±0.41MRTh1.31±0.072.37±0.84#VL·kg-10.50±0.232.26±1.13Cmaxmg·L-11.95±0.210.81±0.49tmaxh0*1.00±0.50*：在靜脈注射中，t=0h血藥濃度最大；#：與Bu單劑量靜注組比較，P<0.05由上表可知，當口服白消安時，在（1.00±0.50）h有最大吸收，達峰濃度為
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本文編號：2892351