為了改善蠶絲的機械性,本研究以piggy Bac轉座子載體為骨架,構建了含有家蠶絲素重鏈蛋白的N-端區(qū)域(NTD)-綠色熒光蛋白(e GFP)-蜘蛛絲蛋白[A2S8]28-重鏈蛋白的C-端區(qū)域(CTD)融合基因表達元件的打靶載體p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD,同時根據絲素重鏈基因內含子區(qū)域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列,設計組裝了TALENs序列,構建了靶向絲素重鏈基因內含子區(qū)域的TALEN 9-10載體;SURVEYOR和lac Z中斷法證實TALEN 9-10載體在家蠶卵母細胞株(Bm N cells)中的效率約為13.95%。將TALEN 9-10載體與打靶載體p XL-NTD-e GFP-Spider-CTD混合,通過真空電穿孔技術,導入家蠶初產卵,篩選獲得G0代轉基因家蠶。PCR檢測結果顯示,G0代轉基因家蠶蠶蛾基因組中有報告基因e GFP(enhance green fluorescence protein gene)的存在;Western Dot Blot檢測轉基因家蠶蠶繭蛋白樣品,證實轉基因家蠶表達...

【文章頁數】：149 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 綜述
    1 轉基因家蠶的研究
        1.1 家蠶轉基因載體系統(tǒng)的構建與發(fā)展
        1.2 外源基因導入家蠶方法
        1.3 利用家蠶生產蜘蛛絲蛋白
    2 基因組編輯技術的發(fā)展及現狀
    參考文獻
第二章 研究目的與研究內容
    1 研究目的與意義
    2 研究內容與技術路線
        2.1 主要研究內容
        2.2 研究技術路線
第三章 常用實驗材料與方法
    1 常用儀器
    2. 常用的實驗方法
        2.1 DNA的連接反應體系
        2.2 連接產物的轉化
        2.3 小劑量抽取質粒DNA的方法(QIAGEN Mini-preps)
        2.4 質粒DNA的中量提取
        2.5 DNA的酶切反應體系
        2.6 家蠶基因組DNA提取
        2.7 目的片段的分離和回收
        2.8 PCR產物的純化
        2.9 PCR擴增目的片段
        2.10 瓊脂糖凝膠電泳
        2.11 細胞的培養(yǎng)和保存
        2.12 BmN細胞基因組的抽提方法
第四章TALENs質粒的構建及其效率在細胞中的檢測
    摘要
    1 引言
    2. 材料與方法
        2.1 TALENs的設計
        2.2 TALENs的構建
        2.3 將構建好的pTAL3- TALEN(9-10) 載體改造為pIE-TALEN(9-10) 載體
        2.4 SURVEYOR核酸酶檢測TALEN(9-10)在BmN細胞中的作用效率
        2.5 Lac Z中斷法檢測TALEN (9-10) 在BmN細胞中的切割特異性
    3 結果與分析
        3.1 pTAL3-TALEN(9-10)質粒的鑒定
        3.2 pIE-TALEN(9-10) 載體的構建
        3.3 SURVEYOR核酸酶檢測pIE-TALEN (9-10)剪切效率
        3.4 lacZ中斷法檢測p IE-TALEN(9-10)切割特異性
    4 討論
    參考文獻
第五章 轉蜘蛛絲蛋白基因的供體質粒pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的構建
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 pXL-BACII-MCS的構建
        2.2 蠶絲重鏈C-段(CTD)的裝配
        2.3 蜘蛛絲基因Spider[A2S8]28的裝配
        2.4 重鏈蛋白的N-端部分(NTD)和eGFP的裝配
    3 結果與分析
        3.1 pXL-BACII-MCS的鑒定
        3.2 pXL-BACII-CTD的鑒定
        3.3 Spider[A2S8]28的裝配及pIEx1Spider的鑒定
        3.4 pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD的鑒定
    參考文獻
第六章 轉基因家蠶的制作、篩選與鑒定
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 真空電穿孔法將質粒導入初產卵
        2.2 電穿孔處理蠶卵的檢測
        2.3 定性檢測轉基因蠶繭及蠶繭蛋白
        2.4 ELISA定量檢測蛛絲蛋白的水平
        2.5 轉基因家蠶的鑒定
        2.6 反向PCR檢測外源基因在家蠶基因組中的定位
    3 結果與分析
        3.1 電穿孔處理家蠶蠶卵的熒光觀察與PCR檢測
        3.2 G0 代轉基因蠶繭的熒光觀察與表達產物檢測
    4 討論
    參考文獻
第七章 轉基因家蠶蠶絲機械性能的檢測
    摘要
    1 引言
    2. 材料與方法
        2.1 蠶絲機械性能的測試具體方法
        2.2 數據分析
    3. 結果與分析
        3.1 轉基因蠶絲的最大極限拉力和最大彈性應力
        3.2 轉基因蠶絲A-D組機械性能指標對比
    4 討論
    參考文獻
第八章 G1 代轉基因家蠶絲的機械性能研究
    摘要
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 轉基因家蠶蠶繭的傳代、分組及轉基因蠶絲蛋白中eGFP含量的檢測
        2.2 繭絲的機械性能的測定方法
    3 結果與分析
        3.1 G1 代轉基因家蠶繭絲蛋白中eGFP含量的測定
        3.2 轉基因繭絲的機械性能
    4 討論
    參考文獻
結論與創(chuàng)新點
資助項目
附錄
    附件一TALENs (9-10)的相關DNA序列
    附錄二pTAL3 載體DNA序列
    附件三pBR322-lac Z載體的DNA序列
    附件四TALENs (9-10)在靶定位點作用效率檢測相關測序結果
    附件五pXL-BACⅡ-NTD-eGFP-Spider[A2S8]28-NTD載體序列
    附件六Piggybac染色體定位DNA序列測序結果
    附件七G1 中的轉基因家蠶繭絲機械性能數據匯總
致謝



本文編號：3967341