發(fā)布時間：2024-06-14 06:20

　　尼古丁作為一種有毒的危險廢棄物,給人們的生存環(huán)境帶來了極大威脅,從煙草廢棄物中去除尼古丁或者將其轉(zhuǎn)化為有價值的化合物顯得尤為重要,而微生物處理方法因其快速、價廉等優(yōu)點被普遍關注。研究微生物降解尼古丁的機理可為揭示尼古丁代謝的生物化學機制和進一步的實際應用提供理論依據(jù)和參考。本論文從杭州農(nóng)藥廠的活性污泥中篩選到一株新型高效降解尼古丁的菌株Shinellasp.HZN7,并對其生理生化特性進行了研究,結(jié)果顯示:菌株HZN7在30～35 ℃時降解效率最高;在pH值6.5～8.0之間降解速率變化不大。在溫度為30 ℃,pH為7.0的條件下,Shinella sp.HZN7能在3小時內(nèi)將濃度為500mg/L的尼古丁完全降解。然后研究了該菌株的代謝中間產(chǎn)物,利用紫外光譜儀(UV)、高效液相色譜儀(HPLC)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)共檢測到五種代謝中間產(chǎn)物,分別為6-羥基尼古丁(6-hydroxy-nicotine,6HN),6-羥基麥斯明(6-hydroxy-N-methylmyosmine,6HMM),6-羥基假氧尼古丁(6-hydroxypseudooxynicotine,6H...

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 尼古丁簡介
        1.1.1 尼古丁的性質(zhì)
        1.1.2 尼古丁的來源和用途
    1.2 尼古丁的污染及危害
        1.2.1 尼古丁的污染
        1.2.2 尼古丁對人類的危害
    1.3 微生物降解尼古丁的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 降解尼古丁的微生物
        1.3.2 尼古丁降解過程中的顏色反應
    1.4 尼古丁的代謝途徑及其分子機制
        1.4.1 吡啶途徑及其分子機制
        1.4.2 吡咯烷途徑及其分子機制
        1.4.3 吡啶和吡咯烷交叉途徑
        1.4.4 脫甲基途徑
    1.5 尼古丁降解菌的生物技術(shù)應用
        1.5.1 尼古丁降解菌降解尼古丁的最佳條件
        1.5.2 尼古丁代謝中間產(chǎn)物應用
    1.6 本研究的目的、意義和主要內(nèi)容
        1.6.1 研究的目的和意義
        1.6.2 研究的主要內(nèi)容
第二章 尼古丁降解菌Shinella sp. HZN7的篩選和鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種、試劑和所用儀器
        2.1.2 培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 尼古丁降解菌株的富集、純化和分離
        2.2.2 菌株的培養(yǎng)特征和生理生化特性的測定
        2.2.3 菌株16S rDNA序列的測定和鑒定
            2.2.3.1 菌株基因組DNA提取
            2.2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR擴增
            2.2.3.3 菌株16S rRNA基因PCR產(chǎn)物的回收和T/A克隆
            2.2.3.4 感受態(tài)細胞的制備與酶連產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.3.5 質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.3.6 16S rRNA序列測定和菌株系統(tǒng)發(fā)育地位的確定
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 尼古丁降解菌的篩選、分離和純化
        2.3.2 菌株HZN7的培養(yǎng)特征及生理生化特性
        2.3.3 菌株HZN7的測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育地位的確定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 Shinella sp. HZN7的降解特性及代謝途徑研究
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株、試劑和所用儀器
        3.1.2 培養(yǎng)基
    3.2 實驗方法
        3.2.1 菌株Shinella sp. HZN7種子液制備
        3.2.2 尼古丁含量測定
        3.2.3 不同pH值下菌株對尼古丁的降解
        3.2.4 不同溫度下菌株對尼古丁的降解
        3.2.5 不同接菌量下菌株對尼古丁的降解
        3.2.6 不同初始尼古丁濃度下菌株對尼古丁的降解
        3.2.7 尼古丁及其代謝中間產(chǎn)物的檢測方法
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 pH值對菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影響
        3.3.2 溫度對菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影響
        3.3.3 接種量對菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影響
        3.3.4 尼古丁初始濃度對菌株Shinella sp. HZN7降解尼古丁的影響
        3.3.5 代謝中間產(chǎn)物測定
        3.3.6 Shinella sp. HZN7降解途徑推測
    3.4 本章小節(jié)
第四章 轉(zhuǎn)座子突變文庫的構(gòu)建與篩選
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株、試劑和儀器
        4.1.2 培養(yǎng)基
    4.2 實驗方法
        4.2.1 菌株誘變前培養(yǎng)
        4.2.2 轉(zhuǎn)座子誘變
        4.2.3 轉(zhuǎn)座子突變株的篩選
        4.2.4 失活突變株降解尼古丁的驗證
        4.2.5 突變株降解液的檢測
    4.3 實驗結(jié)果與討論
        4.3.1 菌株HZN7誘變最適條件
        4.3.2 菌株HZN7插入突變效率
        4.3.3 代表性轉(zhuǎn)座子突變株的初步分析
            4.3.3.1 a型突變株
            4.3.3.2 b型突變株
            4.3.3.3 c型突變株
            4.3.3.4 d型突變株
            4.3.3.5 e型突變株
    4.4 本章小結(jié)
第五章 降解途徑的驗證和其中一株突變株缺失基因的克隆及功能分析
    5.1 實驗材料
        5.1.1 菌株、試劑和儀器
        5.1.2 培養(yǎng)基
    5.2 實驗方法
        5.2.1 6HN,6HMM、6HPON和HSP的制備
        5.2.2 菌株HZN7及其突變株對各種中間產(chǎn)物的降解
        5.2.3 轉(zhuǎn)座子突變基因的克隆
        5.2.4 克隆序列的測定、組裝和分析
        5.2.5 orf2基因的敲除
            5.2.5.1 基因片段的敲除及同源重組片段的構(gòu)建
            5.2.5.2 構(gòu)建同源重組載體
            5.2.5.3 基因敲除重組子的獲得
            5.2.5.4 orf2基因功能
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 菌株HZN7及其突變株降解分析
        5.3.2 降解途徑的確定
        5.3.3 SEFA-PCR克隆突變株N7-X5突變基因的分析
        5.3.4 基因的敲除與功能互補分析
    5.4 討論
        5.4.1 降解途徑
        5.4.2 突變株的選擇
        5.4.3 新代謝產(chǎn)物的預測
    5.5 本章小結(jié)
第六章 論文總結(jié)
    6.1 研究內(nèi)容
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 不足與展望
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間的研究成果
    發(fā)表的文章
    專利



本文編號：3994267