發(fā)布時(shí)間：2024-12-22 07:09

　　Nanog蛋白是維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,特別是在腫瘤干細(xì)胞中,Nanog蛋白的表達(dá)與腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著對腫瘤干細(xì)胞基礎(chǔ)研究的深入,相關(guān)的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)及藥物研發(fā)生產(chǎn)對Nanog蛋白的需求也日益增多。目前體外生產(chǎn)Nanog蛋白的主要方式是利用微生物進(jìn)行異源表達(dá)。已公開的報(bào)道主要是鼠源及豬源Nanog蛋白的原核表達(dá),關(guān)于人源Nanog蛋白的原核表達(dá)研究報(bào)道較少且產(chǎn)量較低,不能滿足日益增長的市場需求。人源Nanog蛋白的高效制備可以有效解決動物源Nanog蛋白在臨床應(yīng)用中引發(fā)的諸多不利因素,滿足科研及生產(chǎn)需求。因此,本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌及重組大腸桿菌表達(dá)菌株,并且探究了重組菌株的發(fā)酵特性。主要研究結(jié)果包括:（1）人源nanog基因與穿梭質(zhì)粒pMA5雙酶切后連接,構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800中實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)。質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)傳代96 h后攜帶重組質(zhì)粒的菌落數(shù)下降至67%。培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后,Nanog蛋白產(chǎn)量達(dá)到189 mg·L^-1。（2）人源nanog基因與質(zhì)粒pET-32a雙酶切后連接,構(gòu)建好...

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1Nanog蛋白與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間的相互作用

mu等[58]的研究表明采用TALEN和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除nanog基因具有抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，增加化療敏感度的作用，但是Nanog蛋白在腫瘤干細(xì)胞中具體的作用機(jī)理仍然難以捉摸。(3)研究Nanog蛋白與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間的相互作用機(jī)制，從而探究....

圖2-2蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

第二章材料與方法19第一階段溫度設(shè)定為37℃，重組菌在含有10g·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，通過葡萄糖定糖儀測定罐內(nèi)葡萄糖殘余量，待其消耗盡后，通過流動加入甘油的方式補(bǔ)充碳源。第二階段在甘油補(bǔ)加3h后將溫度分別設(shè)定為37℃、30℃，30℃維持0.5h，在變溫后添加IPTG對重組....

圖3-1重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

第三章結(jié)果與討論21第三章結(jié)果與討論3.1Nanog蛋白在重組枯草芽孢桿菌中的表達(dá)3.1.1枯草芽孢桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，連接至克隆載體pMD19-TSimpleVector。連接后轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB800，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將....

圖3-2枯草芽孢桿菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubtilis

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文22的蛋白液沉淀中也無法檢測到相應(yīng)大小的蛋白條帶，說明Nanog蛋白僅在重組枯草芽孢桿菌WB800/pMA5-nanog中實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)表達(dá)。圖3-2枯草芽孢桿菌中Nanog的SDS-PAGEFig.3-2SDS-PAGEofNanoginBacillussubt....

本文編號：4019631