煎炸過程中,油脂經(jīng)受高溫的同時曝露于氧氣、水分環(huán)境下會發(fā)生水解、氧化、聚合、熱裂解等一系列反應,并且油脂與其他食物成分的相互作用常常同時發(fā)生,造成煎炸油及煎炸食品的質量、營養(yǎng)降低,甚至帶來健康隱患。叔丁基對苯二酚(TBHQ),因其抗氧化效果好、成本低而被廣泛應用于延緩油脂氧化。然而高溫條件下TBHQ易發(fā)生氧化降解,且氧化、裂解產(chǎn)物眾多。但其產(chǎn)生途徑、煎炸油及煎炸食物中殘留量、生物毒性特點及分子機制等毒理學數(shù)據(jù)仍處于空白狀態(tài),因此亟需對油脂煎炸過程中TBHQ主要降解產(chǎn)物的生成規(guī)律、危害控制及其細胞毒性機制開展研究,從而為油炸工藝質量控制標準制訂提供理論支撐,同時對改善煎炸油及煎炸食品質量、營養(yǎng)與安全,保證消費者健康均具有重要的社會意義。本課題主要針對食用油煎炸過程中TBHQ氧化產(chǎn)物鑒定、主要降解產(chǎn)物叔丁基對苯二醌(TBBQ)的生成途徑、蓄積規(guī)律及環(huán)境參數(shù)的影響開展研究,開發(fā)煎炸油中TBBQ的生成調控及選擇性脫除技術。同時評估TBBQ在煎炸油、煎炸食品中的殘留量,解析TBBQ的細胞毒性及量效關系。重點結合轉錄組測序技術(RNA-Seq)篩選差異表達基因,解析TBBQ誘導細胞毒性的信號通路和關鍵作用靶點,并采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和免疫蛋白印跡(Western-blot)法驗證。從分子水平上揭示TBBQ的細胞毒性機制,為煎炸食品中風險因子TBBQ的安全評估提供基礎數(shù)據(jù)。(1)課題以三棕櫚酸甘油脂(PPP)作為脂質基質,構建模擬煎炸體系,通過GC/MS鑒定了高溫加熱條件下TBHQ的主要產(chǎn)物,結果表明TBBQ是其主要降解產(chǎn)物。同時課題對比了敞口體系和封閉體系在120、170和200~oC加熱情況下油相體系中TBHQ和TBBQ含量的變化規(guī)律。結果顯示隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長,TBHQ的損耗率也逐漸增大。封閉體系170~oC加熱8 h后TBBQ的殘留量最大,其值為164.67±6.02 mg/kg,高于200~oC下TBBQ的最大值(封閉體系加熱5 h后TBBQ含量為120.16±6.03 mg/kg),以及120~oC下的最大值(敞口體系加熱2 h后TBBQ含量為53.63±4.23 mg/kg)。低溫條件下(120~oC)TBHQ的損耗雖有所減弱,但油相體系中TBBQ的殘留量較多。加熱24 h后,封閉體系和敞口體系中TBBQ的濃度在120、170、200~oC下分別為52.61~62.93mg/kg、10.23~46.85 mg/kg、0~7.74 mg/kg。上述結果表明,TBBQ濃度不僅是加熱溫度和加熱時間的函數(shù),同時受揮發(fā)強度及氧氣存在與否的影響。對比敞口體系和封閉體系下TBBQ含量變化規(guī)律,可以發(fā)現(xiàn)TBHQ在高溫加熱條件下的損耗主要以氧化降解為主。此外,假設TBHQ和TBBQ的揮發(fā)是可以忽略的,課題對高溫加熱條件下TBHQ損耗和TBBQ生成的動力學方程進行了初步擬合。研究結果所示:在敞口和封閉體系中120、170、200~oC下TBHQ損耗的一級動力學反應速率常數(shù)分別為0.018、0.23、0.31 h~(-1);0.019、0.22、0.32 h~(-1)。TBBQ生成的一級動力學反應速率常數(shù)分別為0.0091、0.090、0.16 h~(-1);0.031、0.13、0.30 h~(-1),且均方根誤差(RMS)均小于5%,表明模型值與實驗值有較好的一致性。(2)課題探討了不同煎炸溫度(140、170、190~oC)、煎炸油種類(大豆毛油、大豆精煉油、菜籽油、棕櫚油、芝麻油)、煎炸方式(連續(xù)、間歇煎炸)以及煎炸批次等不同的煎炸條件對煎炸油和煎炸薯條中TBBQ生成規(guī)律的影響。結果表明當含有204.89±1.63 mg/kg TBHQ的不同種類食用油在不同煎炸條件下油炸薯條時,在第1批次到第5批次煎炸后,煎炸油和油炸薯條中TBBQ殘留量均超過10 mg/kg。對于煎炸溫度,從TBBQ含量的角度出發(fā),170~oC優(yōu)于190~oC和140~oC。且用不同種類的植物油(包括飽和的棕櫚油和具有抗氧化性的芝麻油)作為煎炸用油對油炸薯條中TBBQ的含量并無明顯差異。相比連續(xù)煎炸模式,間斷煎炸更有利于減少TBBQ的含量。此外,FTIR是監(jiān)測煎炸油中官能團吸收的有效手段,本實驗中發(fā)現(xiàn)845 cm~(-1)處的O-O吸收可以有效的評價含有TBHQ的煎炸油的氧化性能。(3)評價了TBBQ對于RAW 264.7細胞的細胞毒性。課題通過MTT細胞存活率實驗得出不同濃度的TBBQ(0,0.5,1,5,10,20,30μg/mL)對RAW 264.7細胞的生長有不同程度的抑制作用,且對細胞的抑制作用呈TBBQ劑量和作用時間的依賴關系。當TBBQ作用RAW 264.7細胞24 h后,其半抑制濃度(IC_(50))為10.71μg/mL。經(jīng)Hoechst 33258熒光染色后觀察到隨著TBBQ濃度的增加,細胞核表現(xiàn)為致密濃染、皺縮或碎裂狀,熒光染色增強,呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征。通過流式細胞術對TBBQ刺激RAW 264.7細胞后的細胞周期和細胞凋亡進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)隨著TBBQ濃度的增加,細胞凋亡率增大,并且TBBQ抑制RAW 264.7細胞的增殖是將RAW 264.7細胞中DNA的合成抑制在了S期。此外,TBBQ作用RAW 264.7細胞后,可引起細胞內(nèi)ROS水平的升高以及GSH含量的降低,從而引起氧化應激,誘發(fā)細胞凋亡。(4)基于轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn),1μg/mL TBBQ暴露RAW 264.7細胞12 h后共產(chǎn)生758個差異表達基因,其中上調基因442個,下調基因316個。根據(jù)轉錄組測序差異基因分析初步揭示了RAW 264.7細胞對TBBQ毒性應答的可能機制及其相關的信號通路。RT-qPCR的驗證實驗結果表明,RAW 264.7細胞的TBBQ處理組(0.5、1、2μg/mL)和對照組相比,處理組細胞的Caspase-3、8、9、12的mRNA表達量均增高,且Fas,Jnk,Ask1,Jun,Bax,CtsL,Capn2的mRNA表達量與對照組相比同樣增高,Bcl-2的mRNA表達量降低;同時由Western blott免疫印跡結果得出,不同濃度的TBBQ(0.5、1、2μg/mL)處理RAW 264.7細胞12 h后,與空白對照組相比,Bcl-2蛋白的表達呈下調的趨勢(p≤0.01),Fas、Cytochrome c和Cleaved-Caspase-12,-8,-3蛋白的表達都有升高的趨勢(p≤0.01),因此我們認為死亡受體/Fas途徑、溶酶體途徑、內(nèi)質網(wǎng)應激和線粒體途徑共同參與了TBBQ誘導的RAW 264.7細胞凋亡,并且線粒體介導的凋亡途徑是TBBQ誘導的RAW 264.7細胞凋亡途徑中最主要的途徑。(5)研究了以離子液體作為新型萃取劑,對油脂中低濃度TBBQ(10 mg/kg)和高濃度TBBQ(50 mg/kg)的脫除效果。實驗對10種不同陰陽離子的離子液體的脫除效果進行了比較,并篩選出N-丁基吡啶四氟硼酸鹽和1-乙基-3-甲基咪唑硫酸甲酯鹽這兩種效果較好的離子液體進行萃取溫度、油脂與離子液體質量比等萃取條件的優(yōu)化。結果顯示N-丁基吡啶四氟硼酸鹽和1-乙基-3-甲基咪唑硫酸甲酯鹽在油脂與離子液體質量比為1:1,萃取溫度為70~oC時,TBBQ脫除效果最優(yōu),低濃度TBBQ(10 mg/kg)脫除率分別為52.98±1.34%、53.71±2.49%;高濃度TBBQ(50 mg/kg)脫除率分別為55.22±2.09%、53.66±2.08%。而經(jīng)二次萃取后,N-丁基吡啶四氟硼酸鹽對油脂中低濃度TBBQ(10 mg/kg)和高濃度TBBQ(50 mg/kg)脫除率均可達到100%。油脂中離子液體殘留量分析表明其殘留離子液體濃度不高于0.1 ppm。
【學位單位】：浙江工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：O657.63;TS221
【部分圖文】：
其生物毒性特點，量效關系、時效關系，可能的分子機制更是鮮有提及。針對上述科學問題，課題以最廣泛使用的抗氧化劑 TBHQ 為代表，識別鑒定其高溫煎炸條件下的主要的降解危害物，研究其主要降解產(chǎn)物 TBBQ 的生成途徑、蓄積規(guī)律及環(huán)境參數(shù)的影響，開發(fā)煎炸油中 TBBQ 的生成調控及選擇性脫除技術，突破技術瓶頸，改善煎炸油及煎炸食品安全。同時分析煎炸油、煎炸食品中 TBBQ的殘留量，解析 TBBQ 的細胞毒性及量效關系，同時結合轉錄組學技術通過對差異表達基因進行 GO 富集和 KEGG 通路分析，解析 TBBQ 毒性的細胞信號通路及關鍵靶點，并從基因水平（RT-qPCR）和蛋白水平（Western blot）進行驗證，揭示TBBQ 細胞毒性的分子機制。為煎炸食品中風險因子 TBBQ 的安全評估提供基礎數(shù)據(jù)，具有重要學術價值和社會意義，同時為油炸工藝質量控制標準制訂提供理論支撐，同時對改善煎炸油及煎炸食品質量、營養(yǎng)與安全，保證消費者健康均具有重要的社會意義。1.6.2 研究技術路線本論文總體實驗思路及具體技術路線見圖 1-3~圖 1-6.
圖 1-4 煎炸油及煎炸食物中 TBBQ 生成規(guī)律及蓄積動力學研究Fig. 1-4 Study on TBBQ formation and accumulation kinetics in frying oil and Fried food
圖 1-4 煎炸油及煎炸食物中 TBBQ 生成規(guī)律及蓄積動力學研究Fig. 1-4 Study on TBBQ formation and accumulation kinetics in frying oil and Fried food圖 1-5 TBBQ 細胞毒性及分子機制探討技術路線圖
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本文編號：
2858267
