發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 05:31

　　 α-酮戊二酸(α-KG)和丙酮酸(PYR)作為重要的有機(jī)酸,在食品、化工、醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。這兩種酮酸具有較高的商業(yè)價(jià)值(12-15$·kg~(-1)),價(jià)格遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸。目前,利用解脂亞洛酵母發(fā)酵法生產(chǎn)α-KG是最具競(jìng)爭(zhēng)力的生產(chǎn)方法。但是在生產(chǎn)α-KG的過(guò)程中,不僅會(huì)積累一定量的PYR,而且發(fā)酵周期較長(zhǎng),間接增加了生產(chǎn)成本。為了使生產(chǎn)效益最大化,本文對(duì)解脂亞洛酵母發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)兩種酮酸進(jìn)行了優(yōu)化,并研究對(duì)比了三種不同的分離純化方法對(duì)發(fā)酵液中酮酸分離效果的影響,建立了簡(jiǎn)單高效分離發(fā)酵液中的α-KG和PYR的方法。主要研究成果如下:(1)以本研究室前期篩選的誘變菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3為出發(fā)菌株,來(lái)高效聯(lián)產(chǎn)α-KG和PYR。在搖瓶水平上比較了氮源濃度、接種量對(duì)酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響,確定了種子液最佳氮源添加量為4 g·L~(-1),最佳接種量為12%。在15 L發(fā)酵罐水平上比較了溶氧控制參數(shù)和硫胺素濃度對(duì)酮酸聯(lián)產(chǎn)的影響。結(jié)果表明,溶氧水平控制在50%時(shí),發(fā)酵96 h酮酸總產(chǎn)量高達(dá)53.4 g·L~(-1),通過(guò)兩階段溶氧調(diào)控,酮酸總產(chǎn)量高達(dá)64.7 g·L~(-1),比未調(diào)控前提高了21.2%。硫胺素最佳濃度為0.2?g·L~(-1),α-KG和PYR分別高達(dá)24.5 g·L~(-1)、53.7 g·L~(-1)。與未優(yōu)化的對(duì)照相比,酮酸總產(chǎn)量提高了57.9%。(2)利用離子交換法分離發(fā)酵液中的α-KG和PYR。比較了8種不同類(lèi)型的離子交換樹(shù)脂對(duì)酮酸吸附的影響,篩選出了一種優(yōu)先吸附α-KG的D318樹(shù)脂�？疾炝私佑|時(shí)間、溫度以及pH對(duì)D318樹(shù)脂靜態(tài)吸附酮酸的影響,并比較了動(dòng)態(tài)洗脫條件(洗脫劑的選擇、洗脫劑的濃度、pH、流速)對(duì)D318樹(shù)脂洗脫分離α-KG和PYR的影響。結(jié)果顯示D318樹(shù)脂不能有效地分離發(fā)酵液中的α-KG和PYR。(3)結(jié)合鈣鹽沉淀法和有機(jī)溶劑萃取法分離發(fā)酵液中的α-KG和PYR。比較了三種鈣鹽對(duì)發(fā)酵液中的α-KG的沉淀效果,確定CaCO_3為純化α-KG的最佳沉淀劑,α-KG的純度和回收率分別高達(dá)84.5%、99.2%。但分離兩種酸時(shí)發(fā)現(xiàn),在偏中性和高溫條件下,PYR由于不穩(wěn)定易聚合,鈣鹽沉淀法不適合于兩種酮酸的分離。又比較了不同有機(jī)溶劑對(duì)α-KG的提取效果,確定乙酸乙酯為純化α-KG的最佳萃取劑,此過(guò)程中,α-KG和PYR的最終收率分別為92.5%、89.2%。在高真空條件下蒸餾PYR繼續(xù)進(jìn)行分離,純度可達(dá)99.2%和98.5%。(4)利用吸附層析法分離發(fā)酵液中的α-KG和PYR。比較了兩種吸附劑以及三種洗脫體系對(duì)酮酸分離的影響,確定了硅膠為最佳吸附劑,乙酸乙酯與石油醚的混合溶劑為最佳洗脫體系。比較了徑高比、流速、硅膠目數(shù)以及上樣方式對(duì)酮酸分離的影響。吸附層析最佳過(guò)程參數(shù)為:徑高比為1/4,洗脫流速為7 mL·min~(-1),硅膠目數(shù)為200-300目,上樣方式為濕法。最后將層析柱擴(kuò)大到?50?500 mm,α-KG的純度和回收率分別為86.7%和98.7%,PYR的純度和回收率分別為70.9%和99.1%。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：TQ920.6
【部分圖文】：

僅為 0.41 g·g-1。與化學(xué)方法相比，此轉(zhuǎn)化率太低，距離工業(yè)化，一些學(xué)者嘗試將光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata IFO 0005)的遺傳表征，如 L-精氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型[30]，L-纈氨酸和 L-異亮氨物轉(zhuǎn)化率提高到 0.52-0.54 g·g-1之間。雖然轉(zhuǎn)化率得到了提高率還是有待提高。李寅等通過(guò)篩選得到一株以氯化銨為唯一氮rata WSH-IP12)，并且 PYR 產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率都得到了有效提0.62 g·g-1[32]。緊接著，王翠花等不僅獲得一株高產(chǎn) PYR 的光滑球并對(duì)其進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，PYR 的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均得到了1、0.87%[33]。再加上微生物發(fā)酵法對(duì)環(huán)境污染小、具有環(huán)保性法生產(chǎn)酮酸還是非常有競(jìng)爭(zhēng)力的生產(chǎn)方法。酸和丙酮酸聯(lián)產(chǎn)的必要性酵母(Yarrowia lipolytica)是常用的生產(chǎn)酮酸的菌株，其代謝途有的文獻(xiàn)報(bào)道中可以發(fā)現(xiàn)，在利用解脂亞洛酵母發(fā)酵過(guò)程中，生一定量的 PYR。

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章 結(jié)果與討論的過(guò)程優(yōu)化氮源濃度優(yōu)化于發(fā)酵產(chǎn)酸效果有很大的影響，當(dāng)種子液的活而且還能維持較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。而在整個(gè)種子的重要組成部分，主要用于微生物的生長(zhǎng)和含白粉為氮源，考察了 5 種不同的氮源濃度對(duì)于酮酸的積累的差異化比較，來(lái)確定種子培養(yǎng)基不同氮源濃度下，α-KG 的產(chǎn)量沒(méi)有明顯的變而有所下降。從酮酸聯(lián)產(chǎn)的總產(chǎn)量來(lái)說(shuō)，當(dāng)?shù)�量達(dá)到最大，分別為 13.1 g·L-1，12.1 g·L-1。綜

圖 3-2 接種量對(duì)發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)酮酸的影響Fig. 3-2 Effect of inoculation concentration on fermentation(a)初始 OD 值為 5；(b)初始 OD 值為 15■：α-KG；■：PYR；□：菌體干重由圖 3-2b 可知，當(dāng)初始接種量 OD 值為 15 時(shí)，接種體積為 6%時(shí)，酮酸總產(chǎn)量最大，為 23.9 g·L-1。但是從初始接種量 OD 值的角度來(lái)比較，很明顯可以觀察到。始接種量 OD 值為 5 時(shí)的酮酸的總產(chǎn)量普遍高于初始接種量 OD 值為 15 時(shí)的酮酸量。可能是初始接種量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致菌體利用甘油快速生長(zhǎng)，而不利于有機(jī)酸的積累菌體量過(guò)低，甘油利用率降低，也會(huì)延長(zhǎng)整個(gè)發(fā)酵周期。綜合考慮，初始 OD 值為 5種量 12%為最佳接種條件。.1.3 不同溶氧水平下酮酸聯(lián)產(chǎn)的發(fā)酵情況氧是影響微生物生理和代謝的重要環(huán)境因子。尤其在微生物發(fā)酵過(guò)程，溶氧會(huì)影酵的穩(wěn)定性[69]。再加上實(shí)驗(yàn)菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06 C3屬于好氧菌株，溶平的變化會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)、代謝途徑以及產(chǎn)物積累情況。所以本實(shí)驗(yàn)在15 L發(fā)酵平上考察了在4種不同溶氧水平條件下(10%、30%、50%、75%)對(duì)Yarrowia lipolyt
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2858115