發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 04:51

　　 目前纖維素酶的成本過(guò)高是限制燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要因素之一,因而如何提高纖維素酶水解效率,降低纖維素酶用量是當(dāng)前燃料乙醇生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在木質(zhì)纖維原料中,半纖維素會(huì)覆蓋在纖維素表面形成物理屏障,降低纖維素酶對(duì)纖維素的可及性。為克服該屏障作用,原料中的半纖維素需要轉(zhuǎn)化為游離態(tài)或者是被水解為可溶性的糖。研究表明游離態(tài)的木聚糖(闊葉材和禾本科中半纖維素的主要成分)及其水解產(chǎn)物對(duì)纖維素水解有強(qiáng)烈的抑制作用,但是游離態(tài)的甘露聚糖(針葉材中半纖維素的主要成分)及其水解產(chǎn)物對(duì)纖維素水解效率的影響還尚不清楚。因而本文圍繞游離態(tài)的甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對(duì)纖維素酶水解纖維素的影響開(kāi)展系統(tǒng)研究,探究了甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的機(jī)制,并在深入了解其抑制機(jī)制的基礎(chǔ)上探究了緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的有效措施,以期為開(kāi)發(fā)水解得率高、酶制劑使用量少的高效酶水解技術(shù)提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:首先考察了不同種類的甘露聚糖(直鏈甘露聚糖、低分子量半乳甘露聚糖以及高分子量半乳甘露聚糖)對(duì)纖維素水解效率的影響,并探究了甘露聚糖結(jié)構(gòu)特性包括分子量和半乳糖取代基等對(duì)甘露聚糖抑制纖維素水解的影響。研究結(jié)果顯示,這三種甘露聚糖均會(huì)抑制纖維素水解,在纖維素酶水解微晶纖維素Avicel的體系中分別添加2.5mg/mL直鏈甘露聚糖、高分子量半乳甘露聚糖以及低分子量半乳甘露聚糖后,Avicel酶解得率降低了13.75%-39.10%。甘露聚糖對(duì)纖維素水解的抑制作用與甘露聚糖的結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān),高分子量的甘露聚糖對(duì)纖維素水解的抑制作用強(qiáng)于低分子量甘露聚糖的抑制作用,而半乳糖基支鏈的存在會(huì)使甘露聚糖對(duì)纖維素水解的抑制作用能力減弱。探究了甘露聚糖對(duì)單一纖維素酶組分(內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A、外切葡聚糖酶Cel6A和Cel7A以及β-葡萄糖苷酶Cel3A)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響,揭示了甘露聚糖抑制纖維素水解的機(jī)制。通過(guò)探究甘露聚糖對(duì)單一纖維素酶組分水解能力的影響,發(fā)現(xiàn)甘露聚糖對(duì)Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力有強(qiáng)烈的抑制作用,但是對(duì)Cel3A的水解能力沒(méi)有影響。動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明甘露聚糖會(huì)占據(jù)Cel7A的活性位點(diǎn),從而競(jìng)爭(zhēng)性的抑制Cel7A的活力,其中高分子量半乳甘露聚糖對(duì)Cel7A活力的抑制作用最強(qiáng)(抑制常數(shù)K_i為0.43 mg/mL),低分子量半乳甘露聚糖的抑制作用次之(抑制常數(shù)K_i為0.47mg/mL),直鏈甘露聚糖的抑制作用最弱(抑制常數(shù)K_i為0.50 mg/mL)。研究了甘露聚糖水解產(chǎn)物(甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖)對(duì)纖維素水解效率的影響。研究結(jié)果顯示,甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖也會(huì)抑制纖維素水解效率,其中甘露低聚糖抑制纖維素水解的能力最強(qiáng),其次是半乳糖,再次是甘露糖。在纖維素酶水解Avicel的體系中分別添加等量的(5 mg/mL)甘露低聚糖、半乳糖和甘露糖后,Avicel酶解得率分別降低了12.70%、4.23%和3.97%。進(jìn)一步探究甘露低聚糖結(jié)構(gòu)特性包括鏈長(zhǎng)和半乳糖取代基等對(duì)甘露低聚糖抑制纖維素水解的影響可知,甘露低聚糖對(duì)纖維素水解的抑制作用隨甘露低聚糖鏈長(zhǎng)的增加而減弱,隨半乳糖取代基的移除而增強(qiáng)。通過(guò)探究甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖對(duì)單一纖維素酶組分水解能力的影響,發(fā)現(xiàn)甘露低聚糖對(duì)Cel5A和Cel3A的水解能力沒(méi)有抑制作用,但是會(huì)抑制Cel6A和Cel7A的水解能力,而甘露糖和半乳糖對(duì)Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力均有抑制作用。動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明甘露低聚糖是Cel7A的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(抑制常數(shù)K_i為1.57mg/mL)。探究了甘露聚糖酶對(duì)甘露聚糖抑制纖維素水解的緩解作用,并從緩解甘露聚糖抑制的角度揭示了甘露聚糖酶強(qiáng)化木質(zhì)纖維原料酶解的機(jī)制。研究結(jié)果顯示,甘露聚糖酶能有效的緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對(duì)纖維素水解的抑制作用,在纖維素酶水解Avicel的體系中添加5 mg/mL半乳甘露聚糖后,Avicel的酶解得率從38.75%降低到了18.68%,進(jìn)一步添加內(nèi)切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和半乳糖苷酶后,Avicel的酶解得率顯著提高到了35.33%。在纖維素酶水解白云杉纖維素的過(guò)程中,添加甘露聚糖酶后,白云杉纖維素的酶解得率提高了14.29%。進(jìn)一步分析酶解液中纖維素酶活力的變化可知,添加甘露聚糖酶后,酶解液中Cel5A和Cel7A的活力分別提高了14.30%和10.91%,表明甘露聚糖酶可通過(guò)緩解酶解液中甘露聚糖對(duì)Cel5A和Cel7A活力的抑制作用,提高纖維素酶的活力,進(jìn)而強(qiáng)化白云杉纖維素酶解。探究了化學(xué)助劑Tween 80對(duì)甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的緩解作用。研究結(jié)果顯示,Tween 80能在一定程度上緩解甘露聚糖、甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖對(duì)纖維素水解的抑制作用,在纖維素酶水解Avicel的體系中分別添加半乳甘露聚糖(5 mg/mL)、甘露低聚糖(5 mg/mL)、甘露糖(10 mg/mL)和半乳糖(10 mg/mL)后,Avicel的酶解得率從48.60%分別降低到了26.64%、39.96%、39.15%和36.90%,進(jìn)一步添加Tween 80后,Avicel的酶解得率分別提高到了36.00%、46.58%、46.35%和45.00%。動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明Tween 80對(duì)Cel5A和Cel3A的活力沒(méi)有影響,但是對(duì)Cel7A的活力有激活作用,該激活作用可以有效的緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對(duì)Cel7A活力的抑制作用,從而提高酶水解過(guò)程中纖維素酶的活力,進(jìn)而提高木質(zhì)纖維原料的酶解效率。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ353
【部分圖文】：

為增加纖維素酶對(duì)纖維素底物的可及度，提高木質(zhì)纖維原料糖轉(zhuǎn)化效率，在對(duì)原料進(jìn)行酶解之前需要用化學(xué)、物理或者生物等方法對(duì)其預(yù)處理 (Putro et al. and Huang 2014)。盡管預(yù)處理過(guò)程成本較高（平均成本為 20 美元/噸生物質(zhì)），理在提高木質(zhì)纖維原料后續(xù)酶水解效率、減少纖維素酶所需劑量從而降低纖成本中有極為重要的作用(Mosier et al. 2005b)。預(yù)處理提高木質(zhì)纖維原料水解用主要?dú)w結(jié)于以下幾個(gè)方面：（1）移除半纖維素；（2）移除和再分配木質(zhì)素；（纖維素的聚合度和結(jié)晶度；（4）增加原料的孔隙度 (Chandra et al. 2007; Mansfi1999; Pan et al. 2005)。圖 1-1 為預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維原料結(jié)構(gòu)影響的示意圖。經(jīng)發(fā)展，目前針對(duì)不同的原料已開(kāi)發(fā)出了一系列不同的預(yù)處理方法，目前常見(jiàn)方法大致可分為物理法（例如球磨、碾磨、輻射）、化學(xué)法（例如堿、稀酸、有機(jī)溶劑等）、物理化學(xué)法（例如蒸汽預(yù)處理、水解預(yù)處理）和生物法，以及的結(jié)合 (Alvira et al. 2010; Sun et al. 2016)。不同預(yù)處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表1-3所可知，常用的預(yù)處理方法均有其獨(dú)特的一面，同時(shí)均存在一定的缺陷，因而有可以適用于所有底物的，高效的預(yù)處理技術(shù)。故在選擇預(yù)處理技術(shù)時(shí)要充物組分和類型 (Mussatto and Dragone 2016)。

1.3.2.1 纖維素酶系統(tǒng)纖維素酶是水解木質(zhì)纖維原料的主要酶系。纖維素酶系統(tǒng)是由內(nèi)切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和 β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）組成 (Taha et al.2016; Watanabe et al. 2010)。如圖 1-2 所示，內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割無(wú)定形區(qū)纖維素主鏈的 β-1，4 糖苷鍵，生成不同聚合度的、帶有非還原性末端或者還原性末端的寡糖，外切葡聚糖酶 Cel7A 作用于纖維素的還原性末端，Cel6A 作用于纖維素的非還原性末端將其水解為纖維二糖，然后 β-葡萄糖苷酶將纖維二糖進(jìn)一步水解為葡萄糖 (Benoitet al. 2015; van den Brink and de Vries 2011)。單一組分的纖維素酶不能有效的水解纖維素，纖維素的高效水解需要這三種組分的協(xié)同作用 (Henrissat et al. 1985; Nidetzky et al.1994; Zhang and Lynd 2004)。在常見(jiàn)的里氏木霉屬纖維素酶系統(tǒng)中，外切葡聚糖酶Cel7A 的比重高達(dá) 60%左右，外切葡聚糖酶 Cel6A 的比重約為 15%，內(nèi)切葡聚糖酶的比重相對(duì)較低，約 10%左右 (McFarland et al. 2007b)。

第一章 文獻(xiàn)綜述1.3.2.2 半纖維素酶系統(tǒng)和纖維素相比，半纖維素的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，因而水解半纖維素所需要的酶系也更加復(fù)雜。水解木聚糖所需的酶包括內(nèi)切 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）、α-L-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.55）、乙�；�木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）、α-D-葡糖醛酸酶（EC 3.2.1.139）、阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）以及 β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）等 (Taha et al. 2016)。如圖 1-3 所示，內(nèi)切木聚糖酶切割木聚糖主鏈為寡糖，然后由 β-木糖苷酶將其水解為木糖。α-L-阿拉伯糖苷酶和 α-D-葡糖醛酸酶移除相應(yīng)的阿拉伯糖取代基和 4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基 (Iveti et al. 2017; Kumar and Murthy 2013; Saha 2003; Van Dyk andPletschke 2012)。乙酰酯酶作用于乙酰取代基，阿魏酸酯酶則水解阿拉伯糖取代基和阿魏酸之間的酯鍵，從而使得木聚糖和木質(zhì)素分離 (Mosier et al. 2005b)。
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