發(fā)布時(shí)間：2020-10-25 06:27

　　 本研究篩選產(chǎn)酸性蛋白酶菌株,結(jié)合現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù),嘗試通過研制氨基酸原液為進(jìn)一步開發(fā)出新型氨基酸生物有機(jī)肥奠定基礎(chǔ),主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:從魚粉水解液中篩選得到一株產(chǎn)酸性蛋白酶菌株,通過形態(tài)學(xué)觀察及26S rRNA序列分析,對該菌株進(jìn)行鑒定,確定為畢赤酵母屬,命名為Pichia galeiformis strain.Zju-C,采用MEGA7.0中的鄰位相算法構(gòu)建Zju-C菌26S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。為提高目標(biāo)菌產(chǎn)酸性蛋白酶能力,采用紫外線和熱處理等物理誘變手段對其進(jìn)行選育研究。結(jié)果表明,復(fù)合誘變對提高目標(biāo)菌的產(chǎn)酶性能有較為顯著影響,并從眾多正突變菌株中篩選出一株相對高產(chǎn)的優(yōu)勢菌株P(guān)ichia galeiformis strain.Zju-C UV-R2。相比于出發(fā)菌株,該菌延滯期縮短了 4 h,酶活可達(dá)到194.3±1.6 U/mL,為原酶活的1.61倍。通過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定了影響發(fā)酵產(chǎn)酶的三個(gè)顯著因素:鹽度、磷酸氫二鈉濃度和硫酸鎂濃度,利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了響應(yīng)面分析的中心點(diǎn),最后通過響應(yīng)面分析法對顯著影響因子進(jìn)行分析。確定最佳的培養(yǎng)基配方為(g/L):廢糖蜜 50,豆粕粉 50,NaH2P04 11.55,硫酸鎂 1.14,鹽度 22.76,pH 5.0,接種量為3%。酶活理論預(yù)測值為390.7U/mL,實(shí)際酶活為391.6±2.3U/mL,兩者十分相近,說明二階回歸模型具有良好的重復(fù)性和可靠性。在前期搖瓶實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了 7.5L發(fā)酵罐的放大試驗(yàn),在通氣量為4 L/min、攪拌速度為400 r/min的條件下,以3%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵24 h,最后粗酶液酶活達(dá)到419.4±4.5 U/mL。對粗酶液酶活性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究,研究結(jié)果表明,在pH 3.5、45℃條件下,加入0.9 g/L錳離子可以使粗酶液蛋白酶酶活達(dá)到542.9±2.7 U/mL。以此為基礎(chǔ),對氨基酸原液進(jìn)行初步的研制,經(jīng)過7天酶解以及7.5L發(fā)酵罐的發(fā)酵放大,最后發(fā)酵液中氨基酸含量可提高至69.5±1.7mg/mL,比酶解前增加了 39%。其中酶解原料為魚溶漿,魚溶漿亦稱水解魚蛋白,其制法概括起來即是用酸、堿或酶將水產(chǎn)品肉蛋白進(jìn)行部份或全部水解,使之成為可溶性蛋白質(zhì)。經(jīng)過成分檢測分析,確定得到的氨基酸原液可以作為魚蛋白有機(jī)液肥投入生產(chǎn)應(yīng)用,并且對比氨基酸液肥標(biāo)準(zhǔn),雖在氨基酸含量上略有不足,但是距離液肥的成功研制已非常接近。同時(shí)通過田間的簡單試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)氨基酸原液的確具有較顯著增強(qiáng)作物抗逆性的功效。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ440.22
【部分圖文】：

最終成功分離到了?８株具有顯著水解酪蛋白能力的產(chǎn)酸性蛋白酶菌??株。將這些菌依次命名為Ｚｊｕ－Ａ至Ｚｊｕ－Ｈ菌，并利用復(fù)篩方法進(jìn)一步測定每種菌??株發(fā)酵液中的酸性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖２－１所示。??１６０?ｒ?ａ?ｉ?４．５??１４〇?［?Ａ?ｂ?＿?４?畫酶話??￣？，ｎ?／?ｃｄ－?３．５?—ＨＣ值??？＃２０?，?ｄｅ／?Ｗ＼?ｆ??｜＼?ｆ｜?／?＊?３??ＶＭ??ｆ：?ＩＩＩ?ｌ?ｉｌ?１１１?ｒ??Ｚｊｕ－Ａ?Ｚ｜ｕ－Ｂ?Ｚ｜ｕ－Ｃ?Ｚｊｕ－Ｄ?Ｚｊｕ＞Ｅ?Ｚ｜ｕ－Ｆ?Ｚ｜ｕ－Ｇ?Ｚｊｕ－Ｈ??圖２－１各菌種酶活和對應(yīng)ＨＣ值的大小??Ｆｉｇ．?２－１?Ｅｎｚｙｍｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ａｎｄ?ＨＣ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｅａｃｈ?ｓｔｒａｉｎ??注釋：圖上標(biāo)不同小寫字母（ａ，?ｂ）表示差異迗顯著水平（Ｐ＜０．０５）??Ｎｏｔｅｓ：?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｅｔｔｅｒｓ（ａ，?ｂ）?ｍｅａｎ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ?（Ｐ＜０．０５）??２０??

根據(jù)所測得各菌種發(fā)酵酶活的高低，結(jié)合相對應(yīng)的菌落透明水解圈大小，最??終確定以Ｚｊｕ－Ｃ菌株作為出發(fā)菌種進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究，此時(shí)該菌的酶活為??１２０．８±２．３?Ｕ／ｍＬ，由其形成的菌落透明水解圈效果如圖２－２所示。??＿??圖２－２透明水解圈??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ?ｃｉｒｃｌｅ??２．４．２?Ｚｊｕ－Ｃ菌生長曲線繪制??由于Ｚｊｕ－Ｃ菌采用的分批培養(yǎng)模式，故實(shí)際的生長過程基本符合“倒鐘型”??生長曲線特征，分別依次經(jīng)歷了遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期等四個(gè)不同的??生長時(shí)期。從菌株的生長曲線圖２－３不難發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)菌在培養(yǎng)１０ｈ后，呈現(xiàn)出明??顯的指數(shù)式增長趨勢。接近２８?ｈ時(shí)，生長的速度則逐漸的放緩，隨即達(dá)到穩(wěn)定??期，持續(xù)４個(gè)小時(shí)后進(jìn)入衰亡期。總體而言，目標(biāo)菌繁殖速度快，生長周期短，??完成一個(gè)生命周期只需３８ｈ左右，整個(gè)生長階段遵循微生物一步生長規(guī)律。??３?－??２．５?－?１?１??Ｉ．?ｆ??０．５

根據(jù)所測得各菌種發(fā)酵酶活的高低，結(jié)合相對應(yīng)的菌落透明水解圈大小，最??終確定以Ｚｊｕ－Ｃ菌株作為出發(fā)菌種進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究，此時(shí)該菌的酶活為??１２０．８±２．３?Ｕ／ｍＬ，由其形成的菌落透明水解圈效果如圖２－２所示。??＿??圖２－２透明水解圈??Ｆｉｇ．?２－２?Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ?ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ?ｃｉｒｃｌｅ??２．４．２?Ｚｊｕ－Ｃ菌生長曲線繪制??由于Ｚｊｕ－Ｃ菌采用的分批培養(yǎng)模式，故實(shí)際的生長過程基本符合“倒鐘型”??生長曲線特征，分別依次經(jīng)歷了遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期等四個(gè)不同的??生長時(shí)期。從菌株的生長曲線圖２－３不難發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)菌在培養(yǎng)１０ｈ后，呈現(xiàn)出明??顯的指數(shù)式增長趨勢。接近２８?ｈ時(shí)，生長的速度則逐漸的放緩，隨即達(dá)到穩(wěn)定??期，持續(xù)４個(gè)小時(shí)后進(jìn)入衰亡期�？傮w而言，目標(biāo)菌繁殖速度快，生長周期短，??完成一個(gè)生命周期只需３８ｈ左右，整個(gè)生長階段遵循微生物一步生長規(guī)律。??３?－??２．５?－?１?１??Ｉ．?ｆ??０．５
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本文編號：2855595