發(fā)布時間：2020-10-25 01:52

　　 長期或大量的紫外線照射可導(dǎo)致皮膚細(xì)胞脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生過量的活性氧(ROS),造成DNA損傷。局部補充抗氧化劑不僅可提高皮膚的抗氧化能力,并且能夠減少紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷。白藜蘆醇(resveratrol,RES)為天然多酚類化合物,具有顯著的抗氧化作用,用含RES的微乳液預(yù)處理豚鼠背部皮膚后幾乎能完全防止中波紫外線(UVB)誘導(dǎo)皮膚紅斑的形成,并且減輕紫外線誘導(dǎo)的氧化損傷。然而,RES在光、熱條件下不穩(wěn)定,活性減弱,使其在皮膚局部給藥制劑的應(yīng)用上受到限制。因此,構(gòu)建合適的RES局部給藥系統(tǒng),提高RES的穩(wěn)定性并使其在皮膚的表皮層有效蓄積是RES發(fā)揮抗氧化損傷、防護紫外線照射作用的關(guān)鍵。目的:本研究以乳木果酯為固體油脂、辛癸酸甘油酯為液體油脂,構(gòu)成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)。將活性成分RES負(fù)載于NLC并分散于凝膠基質(zhì)中,構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體凝膠(NLC-gel),以提高RES的穩(wěn)定性,增強RES的抗紫外線效果。方法:1.將乳木果酯、復(fù)配乳化劑、維生素E(VE)、紅沒藥醇于80℃加熱至融化,加入4-甲基芐亞基樟腦(Parsol 5000)、丁基甲氧基二苯甲�；�甲烷(Parsol1789)及甲氧基肉桂酸乙基己酯(Parsol MCX),攪拌均勻,待混合物溫度降至40℃,加入RES/辛癸酸甘油酯混合溶液,制得油相;將尿囊素、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、去離子水于80℃加熱并混合均勻,制得水相;60℃下混合水相和油相,采用超聲乳化法制得載藥納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)分散液。將載藥NLC分散液加入羧甲基纖維素鈉凝膠基質(zhì)中,得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體防曬凝膠(NLC-gel)。2.用紫外分光光度計測定NLC-gel在280 nm、290 nm、300 nm、310 nm、320nm處的平均吸光度值。通過單因素實驗考察辛葵酸甘油酯與乳木果酯投料比、白藜蘆醇用量、乳化劑用量、剪切速度、剪切時間、超聲功率及超聲時間對NLC-gel吸光度值的影響。3.采用JMP7.0軟件中的定制設(shè)計對NLC-gel的處方組成及制備工藝進行實驗組別設(shè)計,按照生成的實驗設(shè)計,制備NLC-gel,測定其吸光度值,并采用SPSS軟件中的單變量線性模型進行數(shù)據(jù)分析,獲得最優(yōu)處方工藝。4.采用zeta電位及激光粒度測定儀、透射電鏡等對NLC-gel的粒徑、zeta電位及形態(tài)進行表征;采用黏度計及pH計測定NLC-gel的黏度和pH;采用UV 2000S型防曬系數(shù)體外測試分析儀測定NLC-gel的防曬系數(shù)(SPF)。5.建立同時測定RES、Parsol 5000、Parsol 1789、Parsol MCX含量的高效液相色譜(HPLC)方法,對NLC-gel的穩(wěn)定性進行考察。6.建立HaCaT細(xì)胞長波紫外線(UVA)、UVB損傷模型,采用MTT法檢測NLC-gel對UVA、UVB損傷HaCaT細(xì)胞的防護作用。7.采用多次刺激實驗觀察NLC-gel對家兔皮膚的刺激作用。8.采用激光共聚焦顯微鏡觀察NLC-gel在皮膚組織的蓄積。9.建立小鼠背部皮膚UVB損傷模型,采用HE染色法觀察NLC-gel對小鼠皮膚UVB損傷的防護作用,采用試劑盒檢測NLC-gel對小鼠皮膚組織過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GPx)活性的影響。結(jié)果:1.單因素實驗結(jié)果表明,RES用量、剪切時間和超聲時間顯著影響NLC-gel的吸光度值,并且RES用量與超聲時間、剪切時間與超聲時間之間存在交互作用。2.最優(yōu)的處方組成及制備工藝為:辛癸酸甘油酯與乳木果酯投料比為1:5、RES用量為1%、乳化劑用量為4%、剪切速度為2000 r/min、剪切時間為5 min、超聲功率為180 w、超聲時間為10 min。3.NLC-gel的性狀為乳白色膠狀,均勻細(xì)膩,無分層現(xiàn)象,不干涸或液化,延展性良好,SPF值為43±5,粒徑為(184±12)nm,zeta電位為-(33±2)mV,黏度為(16±1)Pa·s,pH為6.3±0.1。4.建立了同時測定NLC-gel中RES、Parsol 5000、Parsol 1789和Parsol MCX含量的HPLC方法,該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確。紫外老化試驗結(jié)果表明NLC能明顯提高RES、Parsol 5000、Parsol 1789和Parsol MCX的穩(wěn)定性。NLC-gel中RES、Parsol5000、Parsol 1789和Parsol MCX的含量,以及NLC-gel粒徑、黏度、pH在影響因素試驗、加速試驗及長期試驗中均無明顯變化。5.在UVA、UVB損傷HaCaT細(xì)胞模型上,NLC-gel與HaCaT細(xì)胞共孵育6h,能明顯減少UVA和UVB對HaCaT細(xì)胞的損傷。6.NLC-gel對家兔皮膚無刺激性。7.激光共聚焦實驗結(jié)果表明,NLC-gel轉(zhuǎn)運藥物主要蓄積于皮膚表皮層。8.用UVB照射小鼠背部裸露皮膚2 h,24 h后出現(xiàn)明顯紅斑,7天后皮膚厚度增加,表面結(jié)痂;HE染色結(jié)果表明,模型組皮膚結(jié)構(gòu)紊亂,表皮增厚,表皮細(xì)胞大部分壞死,并有明顯的炎細(xì)胞浸潤;而NLC-gel預(yù)處理后的皮膚結(jié)構(gòu)正常,表皮未見增厚,表皮細(xì)胞未見壞死,沒有明顯的炎細(xì)胞浸潤。與正常對照組小鼠相比,模型組小鼠皮膚組織中的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GPx)活性均顯著下降;與模型組小鼠相比,NLC-gel預(yù)處理組小鼠皮膚中CAT、SOD和GPx的活性均顯著升高。結(jié)論:制備的NLC-gel性質(zhì)穩(wěn)定、無刺激性,能有效提高RES的穩(wěn)定性,增加RES在皮膚表皮層的蓄積,減少UVA和UVB對HaCaT細(xì)胞的損傷,有效防御UVB照射誘導(dǎo)的小鼠急性皮膚損傷,增強皮膚的抗氧化作用,具有顯著的開發(fā)應(yīng)用潛力。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ658.24
【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
Abstract
前言
文獻回顧
實驗一 負(fù)載白藜蘆醇納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體防曬凝膠的處方優(yōu)化及表征
    1 材料
        1.1 儀器
        1.2 試劑
    2 實驗方法
        2.1 NLC-gel的制備
        2.2 NLC-gel處方工藝優(yōu)化
        2.3 NLC-gel的表征
        2.4 SPF值的測定
    3 結(jié)果
        3.1 NLC-gel處方工藝的單因素實驗結(jié)果
        3.2 NLC-gel處方工藝交互作用的考察
        3.3 基于JMP7.0軟件的定制設(shè)計優(yōu)化處方
        3.4 數(shù)據(jù)分析
        3.5 驗證實驗
        3.6 NLC-gel的表征
        3.7 SPF值的測定
    4 討論
實驗二 NLC-gel的穩(wěn)定性研究
    1 材料
        1.1 儀器
        1.2 試劑
    2 方法
        2.1 建立同時測定NLC-gel中RES、Parsol1789、Parsol5000和ParsolMCX含量的高效液相色譜方法
        2.2 方法學(xué)考察
        2.3 紫外老化試驗
        2.4 穩(wěn)定性試驗
        2.5 統(tǒng)計學(xué)分析方法
    3 結(jié)果
        3.1 方法學(xué)考察結(jié)果
        3.2 紫外老化實驗
        3.3 穩(wěn)定性試驗
    4 討論
實驗三 NLC-gel對HaCaT細(xì)胞的防護作用
    1 材料
        1.1 實驗細(xì)胞
        1.2 主要實驗藥品及試劑
        1.3 儀器
    2 試驗方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 NLC-gel的細(xì)胞毒性評價
        2.3 HaCaT細(xì)胞紫外線損傷模型的建立
        2.4 NLC-gel對HaCaT細(xì)胞的防護作用
        2.5 NLC-gel對HaCaT細(xì)胞的物理防護作用
    3 結(jié)果
        3.1 NLC-gel的細(xì)胞毒性作用
        3.2 HaCaT細(xì)胞紫外線損傷模型的建立
        3.3 NLC-gel對HaCaT細(xì)胞的防護作用
        3.4 NLC-gel對HaCaT細(xì)胞的物理防護作用
    4 討論
實驗四 NLC-gel對UVB誘導(dǎo)的急性皮膚損傷的防護作用
    1 材料
        1.1 儀器
        1.2 試劑
        1.3 動物
    2 方法
        2.1 皮膚刺激性試驗
        2.2 NLC-gel在大鼠皮膚中轉(zhuǎn)運藥物的分布
        2.3 小鼠皮膚UVB損傷模型的建立
        2.4 NLC-gel對UVB誘導(dǎo)的急性皮膚損傷的防護作用
    3 結(jié)果
        3.1 多次皮膚刺激性試驗
        3.2 NLC-gel轉(zhuǎn)運藥物在大鼠皮膚組織中的分布
        3.3 小鼠皮膚UVB損傷模型的建立
        3.4 NLC-gel對UVB誘導(dǎo)的急性皮膚損傷的防護作用
    4 討論
小結(jié)
參考文獻
個人簡歷和研究成果
致謝

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本文編號：2855286