發(fā)布時間：2020-12-14 19:05

　　本課題組在前期研究中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了玉米大斑病菌StHOG1基因的敲除突變體（ΔStHOG1）。通過分析ΔStHOG1菌株,發(fā)現(xiàn)StHOG1基因參與調(diào)控病菌的高滲脅迫反應(yīng),并推測StMsn2可能為StHog1下游的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其活性受StHog1磷酸化調(diào)節(jié),但其具體的分子機(jī)制尚不清楚。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上以ΔStHOG1菌株為材料,分析StMSN2在轉(zhuǎn)錄及其蛋白表達(dá)水平來明確StHog1對StMsn2的調(diào)控;利用染色體免疫共沉淀（ChIP）、電泳遷移率變動分析（EMSA）及雙熒光報(bào)告系統(tǒng)篩選并驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子StMsn2下游所調(diào)控靶的基因。因此,本研究不僅明確轉(zhuǎn)錄因子StMsn2與StHog1的調(diào)控關(guān)系及StMsn2下游所調(diào)控靶的基因,也對進(jìn)一步完善HOG-MAPK信號通路對調(diào)節(jié)玉米大斑病菌高滲脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制具有重要意義。主要結(jié)果如下:1.StMSN2的cDNA序列包含一個長度為1617 bp的開放閱讀框（ORF）及編碼的蛋白具有兩個保守鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF-C2H2）,分別位于N末端氨基酸的第418⁴41和447⁴69... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 玉米大斑病及其病原菌的生物學(xué)特征
    1.2 病原真菌中的MAPK級聯(lián)途徑
    1.3 植物病原真菌Msn2 類轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 宿主菌株
        2.1.2 試驗(yàn)載體
        2.1.3 植物材料
        2.1.4 各種酶及試劑
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
        2.1.6 培養(yǎng)基
        2.1.7 引物
    2.2 試驗(yàn)試劑的配制
        2.2.1 SDS-PAGE
        2.2.2 Western blot
        2.2.3 His融合蛋白的表達(dá)純化
        2.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP
        2.2.5 凝膠遷移EMSA
        2.2.6 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 StMsn2 多克隆抗體的制備
        2.3.2 ChIP富集StMsn2 特異性結(jié)合的DNA片段
        2.3.3 ChIP-qPCR驗(yàn)證富集的DNA片段
        2.3.4 RT-qPCR檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平
        2.3.5 目的基因的克隆
        2.3.6 StMsn2-His融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3.7 StMsn2-His融合蛋白的純化
        2.3.8 Western blot
        2.3.9 EMSA檢測目的蛋白與探針的結(jié)合
        2.3.10 煙草系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控
        2.3.11 玉米大斑病菌全蛋白的提取
        2.3.12 蛋白質(zhì)的去磷酸化處理
        2.3.13 StMSN2 的生物信息學(xué)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 St MSN2 基因保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.2 StMsn2 多克隆抗體的制備及鑒定
    3.3 StHog1對StMSN2 基因的調(diào)控作用
        3.3.1 高滲脅迫條件下WT中 StHOG1和StMSN2 的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.3.2 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的轉(zhuǎn)錄水平分析
        3.3.3 ΔStHOG1 菌株中StMsn2 的表達(dá)水平分析
        3.3.4 高滲脅迫下StMsn2 的磷酸化分析
    3.4 ChIP技術(shù)對StMsn2 下游靶基因的篩選及驗(yàn)證
        3.4.1 ChIP富集StMsn2 結(jié)合的DNA片段
        3.4.2 StMsn2 下游靶基因的篩選
        3.4.3 ChIP-qPCR驗(yàn)證StMsn2 下游調(diào)控的靶基因
    3.5 EMSA在體外對StMsn2 下游靶基因的驗(yàn)證
        3.5.1 StMSN2 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5.2 StMsn2-His融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.5.3 StMsn2-His融合蛋白的純化
        3.5.4 StMsn2-His融合蛋白的western blot驗(yàn)證
        3.5.5 EMSA體外驗(yàn)證StMsn2 下游所調(diào)控的靶基因
    3.6 煙草系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子對下游基因的調(diào)控
4 討論
    4.1 真菌中Hog1對Msn2 的調(diào)控關(guān)系
    4.2 ChIP技術(shù)對靶基因的篩選及驗(yàn)證
    4.3 EMSA 在體外驗(yàn)證蛋白對 DNA 的調(diào)控
    4.4 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白與靶基因的調(diào)控關(guān)系
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在校期間發(fā)表的論文
作者簡歷
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2916867