發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 22:36

　　 引起小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)的主要病原菌為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearwm,F.g)。作為一種世界性的麥類病害,每年都給小麥生產(chǎn)帶來(lái)較大的損失。禾谷鐮刀菌在侵染小麥的過(guò)程中不僅造成產(chǎn)量損失,而且產(chǎn)生如脫氧雪腐鐮刀烯醇(DON)等真菌毒素,影響小麥的品質(zhì)及商品價(jià)值,嚴(yán)重危害人、畜健康。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)以及物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕�方�?在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到非常重要的作用。近年來(lái),對(duì)植物網(wǎng)格蛋白的研究逐漸增多,發(fā)現(xiàn)植物網(wǎng)格蛋白能調(diào)控膜運(yùn)輸、鹽脅迫、根瘤的形成、生長(zhǎng)素信號(hào)及下胚軸的形成等,但是植物網(wǎng)格蛋白在抗真菌病害方面的研究較少,具體功能不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)感病材料濟(jì)麥22(JM22)以及抗病材料濟(jì)麥22-Fhb7(JM22-Fhb7)接種禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearwm,F.g),進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格蛋白等內(nèi)吞途徑相關(guān)基因的表達(dá)在接種前后差異較大,表明網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑與赤霉病的發(fā)生很可能有密切關(guān)系。本研究,從濟(jì)麥22-Fhb7中克隆得到了網(wǎng)格輕鏈蛋白基因TaCLC1(GenBank No:KT345966),并且對(duì)其進(jìn)行了功能分析。主要結(jié)果與結(jié)論如下:(1)利用同源克隆和生物信息學(xué)方法克隆獲得TaCLC1基因的全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank:KT345966)。該基因全長(zhǎng)1207 bp,包含一個(gè)936 bp開(kāi)放閱讀框,編碼311個(gè)氨基酸,分子量約32.9KDa。TaCLC1為單拷貝基因,位于小麥7BL染色體上;而且TaCLC1與大麥、玉米以及高粱中的網(wǎng)格輕鏈蛋白同源性較高。將TaCLC1::GFP融合蛋白在煙草表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá),利用雙光子顯微鏡觀察到,該融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜中。(2)qRT-PCR結(jié)果表明,TaCLC1在根、莖、葉和穗部均有表達(dá),并且在葉片中的表達(dá)量最高;同時(shí)該基因的轉(zhuǎn)錄受到水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等多種激素及禾谷鐮刀菌的誘導(dǎo)表達(dá)。(3)利用大麥條紋花葉病毒(Barely Stripe Mosaic Virus,BSMV)介導(dǎo)的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing,VIGS)技術(shù),在小麥葉部進(jìn)行了赤霉病的抗性鑒定,結(jié)果顯示,BSMV::TaCLC1植株中腐生斑的面積明顯比對(duì)照植株和BSMV::00植株中腐生斑面積大,同時(shí)禾谷鐮刀菌的相對(duì)數(shù)量也較多,說(shuō)明TaCLC1在小麥中能夠抑制赤霉菌的生長(zhǎng)。(4)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得煙草以及擬南芥TaCLC1過(guò)表達(dá)株系。將禾谷鐮刀菌接種到野生型擬南芥和過(guò)表達(dá)TaCLC1基因擬南芥的葉片上,5d后,統(tǒng)計(jì)各個(gè)株系的發(fā)病情況發(fā)現(xiàn),野生型擬南芥葉片病斑面積小于25%的葉片數(shù)量占總數(shù)的18%,轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片上病斑面積小于25%的葉片占75%,轉(zhuǎn)基因株系中大于75%的葉片數(shù)量占20%;同時(shí)發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥中禾谷鐮刀菌的相對(duì)數(shù)量為轉(zhuǎn)基因的2倍左右。將禾谷鐮刀菌接種到野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草的葉片上,發(fā)現(xiàn)野生型煙草葉片上有明顯的較大病斑,而轉(zhuǎn)基因煙草葉片上僅有個(gè)別的輕微病斑,且病原菌在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中菌絲的生長(zhǎng)量要明顯少于野生型煙草。上述結(jié)果說(shuō)明,TaCLC1在調(diào)控小麥抗赤霉病中發(fā)揮著重要的功能。(5)檢測(cè)TaCLC1基因的沉默小麥植株中水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)合成關(guān)鍵基因TaPAL、TaOPR的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,接種禾谷鐮刀菌后沉默株系中TaPAL、TaOPR的表達(dá)量上調(diào)程度低于野生型。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥中病程相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TaCLC1植株中PR1、PR2和PR3、PR5的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于WT。上述結(jié)果表明,TaCLC1有可能通過(guò)促進(jìn)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)抵御病原菌侵染。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.121.45
【部分圖文】：

圖 3-4 TaCLC1-GFP 融合蛋白在煙草表皮中的亞細(xì)胞定位Fig. 3-4 Subcellular localization of TaCLC1-GFP fusion protein in tobacco epidermis1 基因的表達(dá)模式分析1 基因在禾谷鐮刀菌處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析一心期小麥幼苗，對(duì)小麥幼苗的心葉進(jìn)行注射禾谷鐮刀菌的游動(dòng)孢子3h，6h，12h，24h，36h 和 48h 取接種葉片，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成物 qTaCLC1-5/3，用 qRT-PCR 檢測(cè) TaCLC1 基因轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)，與谷鐮刀菌 1h 后，TaCLC1 基因的轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)始上升，到 6h 達(dá)到高之后又繼續(xù)上升至 36h 到達(dá)頂峰，48h 又回落（圖 3-5）。在 0-6h 內(nèi) MOCK（用于回溶禾谷鐮刀菌游動(dòng)孢子的無(wú)菌水）處理的情況下，水平都出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有可能為目的基因受損禾谷鐮刀菌處理 24h 后，TaCLC1 基因的表達(dá)重新上調(diào)，可能是由于

圖 3-5 小麥 TaCLC1 基因?qū)�禾谷鐮刀菌的響�?yīng)表達(dá)分析Fig. 3-5 Response Analysis of Wheat TaCLC1 Gene to Fusarium graminearum1 基因在不同植物激素誘導(dǎo)處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式分析JA 途徑在植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的調(diào)控作用，并且已SA、MeJA 能夠提高小麥對(duì)赤霉病的抗性。為了明確 TaCLC1 是否，我們?nèi)∫蝗~一心期小麥，分別進(jìn)行噴施 2mM/L SA、0.5 mM/L Me24h，36h 和 48h 取心葉葉片，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取三棵植株，用 qRT-P的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)，在噴施 SA 12h 后，TaCLC1 基因的轉(zhuǎn)錄水平開(kāi)，之后又回落，呈現(xiàn)拋物線特征（圖 3-6A）。而噴施 MeJA 后， 24h 達(dá)到高峰，之后又回落，同樣呈現(xiàn)拋物線特征（圖 3-6B），說(shuō)明 SA、MeJA 處理的誘導(dǎo)表達(dá)。 B

圖 3-7 TaCLC1 基因在小麥中組織特異性表達(dá)分析Fig. 3-7 Tissue-specific expression analysis of TaCLC1 gene in wheS 沉默小麥 TaCLC1 后抗赤霉病分析連接原理，設(shè)計(jì)特異性接頭引物，擴(kuò)增目的基因片的基因與 γ 載體，將酶切處理后的目的基因及線taclc1 已經(jīng)成功連接（圖 3-8）。將 α、β、γ/γ-tac含有 α、β 和 γ 組分的農(nóng)桿菌液按照 1:1:1 的比例混煙展開(kāi)葉，進(jìn)行病毒的擴(kuò)繁，9d 后提取上部葉片測(cè)證明病毒在本生煙中擴(kuò)繁成功（圖 3-9）。利用大技術(shù)（BSMV-VIGS）對(duì) TaCLC1 進(jìn)行基因沉默（汁液摩擦接種一葉一心期小麥葉片，用含有 α、β為 BSMV::00，用 α、β 和 γ-taclc1 病毒汁液摩擦18d 后檢測(cè)接種葉片上部第一片葉的轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2892096