根腐病是藍莓生產(chǎn)當中的重要病害之一,不僅影響著藍莓的品質(zhì)和產(chǎn)量,還能夠使植物整株死亡,造成嚴重經(jīng)濟損失。隨著藍莓種植不斷向新的地區(qū)發(fā)展,不同的種植環(huán)境、品種布局與種苗來源也關系著病害發(fā)生的多樣性。本實驗室2013年-2017年對我國藍莓產(chǎn)區(qū)病害的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的藍莓根腐病,分別由麗赤殼屬真菌與鐮孢屬真菌引起,兩種類型根腐病的癥狀類似,均是侵染植株根部,導致葉片及枝條干枯,并最終造成整株死亡。為明確引起藍莓根腐病的病原菌種類,并為此類病害的防治提供理論基礎,本研究結合傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育種群研究技術,鑒定了分離自藍莓根部的病原菌,比較了不同病菌的生物學特性,評價了不同藍莓品種對根腐病菌的抗感差異,集成與研發(fā)了藍莓根腐病菌PCR快速檢測技術。研究結果如下:1.經(jīng)采集分離與鑒定共獲得4種藍莓根腐病菌經(jīng)采集分離純化,本研究共獲得4株藍莓根腐病代表菌株,鑒定結果顯示菌株HNCS02Bb為木賊鐮孢菌Fusarium equiseti,HNCS02Da為F.commune,SDRS02Ba為F.oxysporum,菌株YNQJ01Aa為冬青麗赤殼Calonectria ilicicola。對得到的根腐病病原真菌進行形態(tài)特征的觀察,鐮孢菌各供試菌株菌落形態(tài)多樣,各菌株均可從大型分生孢子的典型特征判斷屬于鐮孢菌屬,對代表菌株在PDA上25℃條件下培養(yǎng)7 d時的特征進行描述:HNCS02Bb菌落白色至粉色,背面肉色至桃色;HNCS02Da菌落正面白色至紫色,背面通常產(chǎn)生紫色色素;SDRS02Ba菌落正面白色至紫色,背面產(chǎn)生紫色色素。分離到的麗赤殼屬真菌YNQJ01Aa,在PDA上25℃條件下培養(yǎng)7 d時菌落直徑達到90 mm,菌落呈白色至黃色,背面白色至淡黃色,根據(jù)分生孢子棍棒型、兩端鈍圓的特征以及大小鑒定該菌為麗赤殼屬真菌。系統(tǒng)發(fā)育分析與鑒定:經(jīng)過ITS序列的BLAST結果分析表明,4株代表菌屬級別的分類結果與形態(tài)學一致。進行進一步的系統(tǒng)發(fā)育研究,麗赤殼屬的系統(tǒng)發(fā)育研究采用EF-1α,β-tubulin及Histone 3三段基因聯(lián)合,鐮孢菌屬采用EF-1α基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹,對4株藍莓根腐病代表菌株進行進一步的系統(tǒng)發(fā)育分析,結合形態(tài)學特征鑒定。結果顯示,3株鐮孢菌代表菌株鑒定結果為HNCS02Bb為木賊鐮孢菌Fusarium equiseti(屬F.incarnatum-equiseti復合種),HNCS02Da為F.commune,SDRS02Ba為F.oxysporum(屬尖孢鐮孢菌復合種),麗赤殼屬菌株YNQJ01Aa為冬青麗赤殼Calonectria ilicicola,其無性態(tài)為寄生帚梗柱孢霉Cylindrocladium parasiticum。同時本實驗室還發(fā)現(xiàn)了一種由麗赤殼屬造成的莖部病害,經(jīng)鑒定其病原菌為Calonectria canadensis,無性態(tài)為Cylindrocladium canadense,該病原菌也用于后續(xù)PCR檢測試驗中的驗證。2.4種藍莓根腐病病原菌的生物學特性存在差異研究了不同氮源、碳源、不同培養(yǎng)基、光照與p H對藍莓根腐病4株代表菌株菌絲生長的影響,結果顯示:F.equiseti菌株HNCS02Bb,F.commune菌株HNCS02Da與F.oxysporum菌株SDRS02Ba在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落直徑無顯著差異,C.ilicicola菌株YNQJ01Aa最適碳源為可溶性淀粉。HNCS02Da的最適氮源為半胱氨酸,HNCS02Bb的最適氮源為半胱氨酸和Na NO3,SDRS02Ba與YNQJ01Aa的最適氮源為Na NO3。4株供試菌株均在PDA,OA和藍莓汁培養(yǎng)基上菌絲生長良好。HNCS02Da與SDRS02Ba的最適生長溫度為25°C-30°C,YNQJ01Aa與HNCS02Bb的最適生長溫度為25°C。3種光照條件對供試菌株菌絲生長速率的影響不明顯。供試菌株在p H為4-8范圍內(nèi)均能夠生長,HNCS02Da在液體培養(yǎng)基中菌絲生長較其他3株供試菌緩慢,HNCS02Bb適宜p H為6,SDRS02Ba最適p H為5,YNQJ01Aa最適p H為4。3.不同藍莓品種的對4種根腐病病原菌敏感性存在差異選擇6個供試品種進行4株供試菌株接種,比較敏感性差異,并選取4株供試菌均能夠侵染的‘奧尼爾’品種進行葉片與枝條的接種,比較供試菌株之間致病力的差異。在不同品種的敏感性差異研究中,接種30 d時,菌株HNCS02Bb對供試品種‘埃利奧特’與‘夏普藍’未表現(xiàn)出致病性,HNCS02Da對全部供試品種有致病性,但是不同品種發(fā)病程度不同,供試菌株SDRS02Ba對‘埃利奧特’品種未表現(xiàn)致病性,YNQJ01Aa對‘夏普藍’品種未表現(xiàn)致病性。菌株YNQJ01Aa除可以侵染藍莓的根部外,還可侵染葉片與枝條,且發(fā)病迅速,3種鐮孢菌中HNCS02Bb與HNCS02Da除可以侵染藍莓的根部外也可以侵染藍莓葉片與枝條,但致病力較弱,只有SDRS02Ba不具備侵染葉片的能力,只能侵染根部和枝條,對枝條致病性力弱。4.分別設計了C.ilicicola與F.equiseti的種特異性引物,集成了前人發(fā)表的F.oxysporum與F.commune種特異性引物本研究鑒定出的4種病原菌中,F.oxysporum與F.commune在PCR檢測方面,前人的研究有很多,因此,可采用已報道的引物進行檢測。而C.ilicicola與F.equiseti相關研究較少,本文針對這兩個種進行了特異性引物的設計與驗證,C.illicola特異性引物Cail4F/R基于β-tubulin基因設計,產(chǎn)物片段長度362 bp,F.equiseti特異性引物Feq EF/R基于EF-1α基因,其產(chǎn)物長度200 bp。經(jīng)驗證,兩對引物的特異性較好,只能對目標菌擴增出條帶,而對非目標的藍莓根腐病菌種類、藍莓其他屬的病原菌以及寄主植物藍莓的總DNA不會擴增出條帶。引物靈敏度測試結果顯示,Cail4F/R可以檢測出25μl體系中100 pg的目標真菌DNA,Feq EF/R可以檢測出25μl體系中1 ng的目標真菌DNA。對于F.oxysporum與F.commune的特異性檢測,本研究應用了前人設計的引物,最終確定引物C1/C2與FO1/FO2靈敏度與特異性較好。4對引物相結合,可實現(xiàn)對藍莓根部病原菌的檢測,其退火溫度相近,可以在同一反應條件下擴增。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.639
【部分圖文】：

Lombard等(2010)基于ACT.,BT,CAL.,HIS3.,ITS,LSU.以及EF-1

11圖 1-2 Watanabe 等 (2011) 對 Fusarium 屬基于 EF-1α與 RPB2 建立的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1-2 Phylogenetic tree based on EF-1α and RPB2 of the genus Fusarium by Watanabe et al.(2011)

圖 2-1 鐮孢菌根腐病癥狀及 3 株代表菌株菌落形態(tài)腐病原始發(fā)病癥狀；B. 病害標本的縱切圖；C. 菌株 HNCS02Bb 在 PDA 上；D. 菌株 HNCS02Da 在 PDA 上 25 °C 條件下培養(yǎng) 7 d 的菌落；E. 菌株 SDRS The symptoms of blueberry root rot caused by Fusarium and characterirepresentitive isolates
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