背景杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性兒童時期最常見的致死性X連鎖隱性遺傳病,主要致病原因為DMD基因突變,臨床上尚無有效的治療手段,主要通過糖皮質(zhì)激素的應用來延緩病情。目前DMD的治療研究重點已深入到基因治療水平。在外顯子51存在的情況下,通過敲除或跳躍第51外顯子,可以使13%的DMD患者變?yōu)锽MD從而延緩病情。DMD患者來源的iPSC是進行DMD疾病研究的模型,也是治療效果評價的較好的模型,通過CRISPR/Cas9對DMD等單基因遺傳病患者來源的iPSCs進行基因修飾,可獲得同一來源遺傳背景一致的未修飾的患病細胞及修飾過的對照組的細胞。然而在臨床上獲得適合Exon51外顯子敲除的DMD患胎來源的iPSC較為困難。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對正常人來源的H1細胞誘導的成肌細胞進行基因修飾,將其變成適合Exon51外顯子敲除的突變細胞類型,然后進行基因修飾研究是一個合理的解決辦法。本實驗中,使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建DMD基因Exon50缺失的H1細胞來源的成肌細胞系,并將DMD基因Exon51進行靶向敲除,通... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

MSC樣細胞分化流程圖

驗結(jié)果gRNA 活性檢測序列經(jīng) Cas9/sgRNA 切割后由于缺乏修復模板，將主要以非）的方式進行隨機修復，或多或少會插入或刪除一些堿基。因 擴增后經(jīng)變性、退火，將形成錯配。錯配酶（主要是 CEL1 或配的雜合雙鏈并剪切。將產(chǎn)物進行凝膠電泳，就可以通過比割條帶的比例，即可反映出 Cas/sgRNA 的活性（見圖 2）。

圖 3 A1-A4：流式細胞儀篩選后，顯微鏡下挑選綠色熒光強的克隆每次傳代后的白色熒光下（100×）的 H1 細胞圖片；B1-B4：白色熒光相對應的同視野下綠色熒光圖（100×）。經(jīng)過數(shù)次挑克隆傳代，在綠色熒光顯微鏡下顯示 H1 細胞綠色熒光區(qū)域接近100%。（2）H1 敲除鑒定在篩選到可穩(wěn)定傳代的＞90%綠色熒光遺傳的 H1 細胞后，提取 H1 細胞基因組行 DMD 基因 MLPA 檢測其 Exon50 外顯子缺失情況（見圖 4）。


本文編號：2909258