發(fā)布時(shí)間：2020-11-21 22:49

　　 自中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)移性粘菌素耐藥基因mcr-1以來(lái),全球范圍內(nèi)已有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)檢測(cè)到了mcr-1基因。mcr-1基因可通過(guò)質(zhì)�；蜣D(zhuǎn)座的形式在不同地區(qū)不同菌屬之間擴(kuò)散,不僅對(duì)公共健康造成巨大威脅,也給臨床抗感染治療帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。目前檢測(cè)到攜帶mcr-1基因的樣本種類與分布地區(qū)眾多,但樣本來(lái)源主要集中在動(dòng)物、生肉、環(huán)境與臨床,其中臨床分離得到的mcr-1陽(yáng)性菌株相對(duì)較少。已報(bào)道的能夠攜帶mcr-1的菌種主要為環(huán)境或院內(nèi)感染相關(guān)的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌,而對(duì)于mcr-1在引起急性腹瀉的腸致瀉性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀菌等重要腸道致病菌中的流行分布情況的研究較少。此外,mcr-1在腸道致病菌中的傳播特性及mcr-1陽(yáng)性菌的親緣進(jìn)化關(guān)系并不清楚,亟需開(kāi)展研究。研究目的篩查從部分地區(qū)醫(yī)院腹瀉患者樣本中收集的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀菌等重要腸道致病菌,揭示mcr-1基因在腸道病原菌中的分布情況及傳播規(guī)律;分析攜帶mcr-1腸道病原菌的耐藥特點(diǎn),為多粘菌素耐藥菌的科學(xué)治療提供依據(jù);分析人源mcr-1陽(yáng)性的大腸埃希菌、沙門(mén)菌和志賀菌的遺傳特征,為有效監(jiān)測(cè)和控制粘菌素耐藥基因mcr-1在人群中的傳播以及暴發(fā)流行的預(yù)警提供依據(jù)。研究方法采集腹瀉患者臨床樣本及病人基本信息,按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》對(duì)收集的腹瀉標(biāo)本進(jìn)行菌株的分離培養(yǎng)與鑒定;利用PCR和Sanger測(cè)序?qū)�mcr-1基因進(jìn)行篩檢,通過(guò)微量肉湯梯度稀釋法對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌進(jìn)行抗生素敏感性分析;應(yīng)用PFGE技術(shù)對(duì)攜帶mcr-1腸道病原菌進(jìn)行分型;通過(guò)S1-PFGE技術(shù)與Southern-blot技術(shù)對(duì)攜帶mcr-1的質(zhì)粒進(jìn)行分型與定位;通過(guò)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢查mcr-1陽(yáng)性質(zhì)粒的傳播特性;利用PCR、質(zhì)粒測(cè)序和全基因組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒特點(diǎn)、遺傳多態(tài)性等分子特性進(jìn)行研究。研究結(jié)果1.共收集或分離鑒定2003-2015年間的我國(guó)部分地區(qū)的腸道致病菌株共計(jì)16950株,其中志賀菌3821株、大腸桿菌1024株、沙門(mén)氏菌12105株。共檢出76株mcr-1陽(yáng)性菌株,其中包括志賀菌7株,沙門(mén)氏菌28株,大腸桿菌41株。其中非典型致病性大腸桿菌與鼠傷寒沙門(mén)菌的檢出量最多。2.通過(guò)對(duì)就診患者的基本信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析發(fā)現(xiàn),僅12.86%(9/70)的mcr-1陽(yáng)性菌分離于成年人樣本,在所有人源性mcr-1陽(yáng)性樣本中有77.41%(54/70)的樣本來(lái)源于4歲以下兒童,兒童患者的平均年齡僅為1.4歲。3.通過(guò)對(duì)mcr-1陽(yáng)性菌進(jìn)行抗生素敏感性分析發(fā)現(xiàn),其中耐藥率最高的3種藥物分別為黏菌素100.00%(76/76)、磺胺異噁唑84.21%(64/76)和四環(huán)素78.95%(60/76);其中敏感性最高的三種藥物分別為環(huán)丙沙星90.79%(69/76),頭孢西丁89.47%(68/76)與阿莫西林克拉維酸鉀80.26%(61/76)。4.mcr-1陽(yáng)性菌株的多重耐藥現(xiàn)象明顯。有12株(15.79%)菌同時(shí)對(duì)第三代頭孢和喹諾酮類藥物耐藥,69株(90.79%)菌同時(shí)對(duì)三種或三種以上抗生素耐藥,只有2株菌僅對(duì)黏菌素一種藥物耐藥。mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌與志賀菌抗生素耐藥譜有差異。5.所有mcr-1陽(yáng)性腸道病原菌共檢測(cè)到4種質(zhì)粒骨架類型,分別為Inc X4,Inc I2,Inc HI2與Inc F型。6.mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌中Inc X4型質(zhì)粒檢出率最高(19/41,46.3%),沙門(mén)氏菌Inc H型質(zhì)粒檢出率最高(13/28,46.0%),志賀菌中只檢測(cè)到Inc I質(zhì)粒類型。7.大腸桿菌PFGE分析結(jié)果顯示41株mcr-1陽(yáng)性大腸桿菌基因組具有異質(zhì)化特性。在28株沙門(mén)氏菌中檢測(cè)到具有高度同源的優(yōu)勢(shì)菌株。8.通過(guò)SNPs進(jìn)化分析樹(shù)發(fā)現(xiàn)部分鼠傷寒沙門(mén)菌親緣關(guān)系密切,可能是同一個(gè)流行的克隆群。研究結(jié)論1.在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1基因的人源性宋內(nèi)志賀菌、人源性旺茲沃思和腸炎型沙門(mén)菌,在這些分離到的mcr-1基因的大腸桿菌中,非典型腸致病性大腸桿菌(a EPEC)與鼠傷寒沙門(mén)菌為優(yōu)勢(shì)型別,而這兩種可導(dǎo)致醫(yī)院感染和暴發(fā)性食物中毒,給公共衛(wèi)生安全帶來(lái)極大的威脅。2.在我國(guó)上海地區(qū)分離的mcr-1陽(yáng)性腸道致病菌中,大腸桿菌中的陽(yáng)性率(4.0%)顯著高于沙門(mén)氏菌與志賀菌,并且在無(wú)癥狀人群中也檢測(cè)到了mcr-1陽(yáng)性菌株,意味著mcr-1陽(yáng)性菌在部分地區(qū)已出現(xiàn)傳播,引起感染。3.在攜帶mcr-1基因的樣本中,來(lái)源于4歲以下兒童的樣本相對(duì)較多,應(yīng)加強(qiáng)對(duì)學(xué)校及家庭公共衛(wèi)生安全知識(shí)的普及,增強(qiáng)個(gè)人消毒防護(hù)意識(shí),減少食品與水源污染給兒童健康帶來(lái)的威脅。4.mcr-1陽(yáng)性腸道致病菌多重耐藥的現(xiàn)象十分明顯,攜帶mcr-1的多重耐藥與泛耐藥菌成為臨床治療中面臨的更為棘手的問(wèn)題。5.不同菌屬的mcr-1腸道致病菌對(duì)相同藥物的耐藥差異明顯,其中沙門(mén)氏菌對(duì)頭孢菌素類和β內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)出較高水平耐藥,并且泛耐藥現(xiàn)象顯著;大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類和磺胺嘧啶類抗生素表現(xiàn)出較高水平耐藥;志賀菌中有4株同時(shí)攜帶阿奇霉素與第三代頭孢菌素抗性,表現(xiàn)出多重耐藥的表型特征。6.攜帶mcr-1的a EPEC型大腸桿菌的異質(zhì)化趨勢(shì)明顯;在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)了收集于2012-2015年間的mcr-1陽(yáng)性沙門(mén)氏菌優(yōu)勢(shì)克隆群,推測(cè)該克隆群在2015年間可能發(fā)生了傳播造成了感染。7.腸道致病菌所攜帶的mcr-1質(zhì)粒類型復(fù)雜多樣,主要為Inc X4、Inc I和Inc H質(zhì)粒類型,其中Inc I類型質(zhì)粒廣泛分布于本次檢測(cè)的3種腸道致病菌中;其中致瀉性大腸桿菌攜帶mcr-1質(zhì)粒類型更復(fù)雜多樣,以Inc X4和Inc I為主,沙門(mén)菌以Inc H類型質(zhì)粒為主。8.在SNPs進(jìn)化分析中親緣關(guān)系密切的鼠傷寒沙門(mén)菌可能是同一個(gè)流行的克隆群。意義和創(chuàng)新1.迄今為止,我國(guó)還沒(méi)有規(guī)模性的對(duì)mcr-1基因在人源性腸道病原菌中分布規(guī)律的調(diào)查分析,通過(guò)對(duì)部分地區(qū)醫(yī)院腹瀉患者樣本中的腸道病原菌進(jìn)行篩查,我們揭示了mcr-1基因在大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、志賀菌三類腸道病原菌中的分布情況及傳播規(guī)律,為控制黏菌素耐藥性的傳播提供了可靠的理論依據(jù)。2.通過(guò)對(duì)收集菌株的篩查,我們研究了mcr-1陽(yáng)性人源性腸道病原菌在部分地區(qū)的分布狀況、傳播關(guān)系、耐藥性特點(diǎn)、遺傳多態(tài)性及傳播機(jī)制,為mcr-1陽(yáng)性腸道病原菌的危害評(píng)估提供了科學(xué)依據(jù)。3.通過(guò)基因組測(cè)序分析,我們研究了攜帶mcr-1質(zhì)粒在腸道病原菌中的轉(zhuǎn)移特性和不同菌屬間攜帶mcr-1質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為預(yù)防控制此類mcr-1基因的傳播提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

介導(dǎo)的能夠水平轉(zhuǎn)移的多黏菌素抗性基因 mcr-1最初是在2中國(guó)收集的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的[1]。MCR-1胺轉(zhuǎn)移酶家族，其蛋白的活性位點(diǎn)與磷酸甘油胺轉(zhuǎn)移酶相似加到類脂 A 從而修飾 LPS，增加了 LPS 攜帶的正電荷，降S 結(jié)合的可能性，因此對(duì)多粘菌素類藥物產(chǎn)生抗性，其作用色體突變導(dǎo)致的抗性[3]，LPS 在肺炎克雷伯菌中的調(diào)控機(jī)制菌素抗生素的抗性外，MCR-1 蛋白的存在還可以使菌株對(duì)溶在大腸桿菌中，MCR-1 蛋白的存在可以將菌株對(duì)多粘菌素的nimuminhibitoryconcentration，MIC）提高 4 到 8 倍。在沒(méi)有菌素抗性的因素的作用下，僅通過(guò) MCR-1 蛋白的作用便足以克雷伯菌等一些腸桿菌產(chǎn)生對(duì)多粘菌素的抗性。

第 41 頁(yè)圖 3. 1 Mate-pair 文庫(kù)構(gòu)建流程（1）基因組 DNA 的片段化處理。所需要的基因組 DNA 的質(zhì)量約為 5μg，使用特定的配對(duì)轉(zhuǎn)座酶，對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行片段化處理，對(duì)破碎后的片段通過(guò)磁珠進(jìn)行片段大小的篩選，之后連接上生物素配對(duì)接頭，再次用磁珠對(duì)加接頭后的片段進(jìn)行純化。（2）鏈置換反應(yīng)。使用多聚酶補(bǔ)平 DNA 由于片段化處理造成的缺口，在連接生物素連接頭的 DNA 片段上有一條鏈的末端與連接頭之間有一個(gè)小的缺口，鏈置換反應(yīng)就是補(bǔ)平 DNA 為后面環(huán)化做準(zhǔn)備，在操作過(guò)程中使用磁珠去除了樣品中小于 1500bp 的小片段，僅保留了含有生物素的大片段。

（4）線性 DNA 的消化過(guò)程。通過(guò)在樣本中加入 DNA 核酸外切酶去除所有以線性狀態(tài)存在的 DNA，盡可能多的保留完整的環(huán)狀 DNA。在滅活核酸外切酶之后需要加入停止環(huán)化反應(yīng)的試劑滅活連接酶。（5）剪切環(huán)化DNA.使用超聲破碎儀將環(huán)化的DNA用打斷成約300-1000bp帶有粘性末端的小片斷，過(guò)程中用磁珠篩選與純化片段（6）鏈霉親和素珠子吸附，使用能夠特異性吸附包含生物素化接頭的磁珠篩選含有生物素接頭的片段，去除其他片段。（7）末端修復(fù)補(bǔ)平。配置修復(fù)反應(yīng)的體系 30℃孵育 30min，之后用磁珠純化獲得的片段。（8）片段加 A 尾。所有片段的 3’末端被加入一個(gè) A 堿基，而與之互補(bǔ)配對(duì)的接頭的 3’末端含有一個(gè)單個(gè)的 T 堿基，因此兩條鏈可以配對(duì)連接。（9）在片段末端加接頭，片段加上接頭后需要用磁珠純化，接頭的添加過(guò)程如下。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李彥;于麗;;乳酸菌對(duì)腸道病原菌的抑菌試驗(yàn)[J];黑龍江商學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1989年02期

2 ;姚玉峰課題組在腸道病原菌致病機(jī)制研究領(lǐng)域取得新進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年05期

3 楊立軍,張晶,李杰;GENESTAR技術(shù)在胃腸道病原菌診斷中的應(yīng)用[J];陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);1999年03期

4 江智輝,蒲桂珍,王海清,朱學(xué)英;蔬菜、水果等食品腸道病原菌的分布調(diào)查[J];中國(guó)人獸共患病雜志;1990年05期

5 馬志強(qiáng);;衛(wèi)生從業(yè)人員腸道病原菌攜帶情況調(diào)查[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2008年03期

6 徐海濱,郭維植,陳建輝,王伙聰;實(shí)驗(yàn)獼猴腸道病原菌檢測(cè)分析[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

7 陳立新;劉秀軍;劉曉峰;王寶蘭;饒丹;;2010年北京市通州區(qū)腸道病原菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J];中華疾病控制雜志;2011年10期

8 張莉;吳潤(rùn);劉磊;;22種中草藥對(duì)畜禽常見(jiàn)腸道病原菌的體外抑菌作用[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年05期

9 簡(jiǎn)風(fēng)蘭;張玉華;王群;孫秀玉;劉冬蘭;;幼兒園兒童攜帶腸道病原菌的調(diào)查報(bào)告[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;1992年04期

10 劉楠楠;劉菲菲;戰(zhàn)海濤;王蘊(yùn);徐淑鳳;;強(qiáng)化氣道管理對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎發(fā)生率影響的研究[J];中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 梁蓓蓓;mcr-1基因在腸道病原菌中的分布特征與傳播規(guī)律研究[D];軍事科學(xué)院;2018年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 魏夢(mèng)楠;污水再生水中典型腸道病原菌的培養(yǎng)鑒定及定量檢測(cè)研究[D];西安建筑科技大學(xué);2010年

2 李賢舟;膜膽固醇在腸道病原菌黏附和侵襲腸上皮細(xì)胞中作用探析[D];揚(yáng)州大學(xué);2014年

3 陳虹;中草藥對(duì)8種畜禽腸道病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2893719