發(fā)布時間：2020-11-21 16:50

　　 研究背景:病原菌的快速準(zhǔn)確鑒定和耐藥性分析對于人體健康,安全檢查和食品安全控制至關(guān)重要。提高抗生素藥敏實驗的時效性是避免抗生素濫用和減少抗生素耐藥的關(guān)鍵。臨床常規(guī)病原菌鑒定和藥敏試驗依賴于細菌培養(yǎng)的鑒定方法,該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確,但操作繁瑣,檢測周期超過24小時,尚不能滿足臨床病原菌快速偵檢的實際需求。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的鑒定方法如實時熒光PCR已廣泛用于檢測和鑒定細菌,提高了檢測效率,但仍存假陽性和無法區(qū)分病原菌生存狀態(tài)等不足。新型質(zhì)譜診斷技術(shù)簡便快速,質(zhì)譜技術(shù)已從實驗室研究廣泛走向臨床微生物的種屬鑒定分析,但其檢測尚依賴于細菌培養(yǎng),檢測靈敏度有待提高。因此,建立一種簡便快速、無標(biāo)記的細菌鑒定方法,對于臨床常見致病菌的有效甄別和耐藥性分析、公共安全細菌監(jiān)測和食品安全檢查均具有重大現(xiàn)實意義。拉曼光譜是一種散射光譜,拉曼散射(Raman scattering)是由光照射到物質(zhì)上產(chǎn)生的非彈性散射,這種非彈性散射改變了入射光子的頻率,拉曼散射光和瑞利光的頻率之差稱之為拉曼位移。拉曼位移取決于生物分子的振動和轉(zhuǎn)動頻率,與生物分子的化學(xué)鍵、官能團等相關(guān)。因此,拉曼光譜為每一種物質(zhì)所特有的特征指紋譜,拉曼光譜的峰位置、強度、線寬等特征與物質(zhì)分子的振動、轉(zhuǎn)動能級相關(guān),提供了生物分子的結(jié)構(gòu)和含量等信息。拉曼光譜在生物分子的定性、定量檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景,然而,由于分子的拉曼散射截面小、拉曼散射信號微弱,難以直接檢測。表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman scattering,SERS)是指入射光在粗糙的類自由電子的金屬如金、銀、銅等基底表面,激發(fā)金屬產(chǎn)生表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR),在基底表面產(chǎn)生局域等離子體電場增強,進而產(chǎn)生SERS�；�于SPR的SERS增強因子可達10~6-10~(12),因此,SERS具有更高的探測靈敏度、分辨率和信噪比�；�于SERS的檢測方法在微生物檢測相關(guān)的食品安全、環(huán)境檢測和臨床診斷等領(lǐng)域已有相關(guān)報道�；�于SERS的病原菌檢測包括標(biāo)記檢測和無標(biāo)記檢測兩大類。SERS無標(biāo)記檢測無需拉曼分子標(biāo)簽,提供了病原菌的特征拉曼光譜信息,有望用于病原菌的快速定性檢測。SERS增強材料包括金屬基底和金屬溶膠,其中金屬溶膠由于制備簡便、成本低、易于保存而廣泛應(yīng)用。銀納米顆粒(silver nanoparticles,AgNPs)對于病原菌的SERS增強性能優(yōu)越,應(yīng)用最為廣泛。然而,臨床病原菌的鑒定缺乏標(biāo)準(zhǔn)的病原菌拉曼光譜數(shù)據(jù)庫,病原菌的拉曼位移峰的歸屬尚不明確,無標(biāo)記SERS技術(shù)對于致病菌的耐藥性分析更是鮮有報道。綜上所述,本研究針對臨床對于病原菌快速檢測和耐藥性分析的迫切需求,結(jié)合SERS技術(shù)、多變量統(tǒng)計分析和機器學(xué)習(xí)方法等,探索不同納米材料檢測病原菌的表面增強拉曼散射效應(yīng)(SERS效應(yīng)),建立基于AgNPs的SERS檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計分析,用于臨床常見病原菌種屬鑒定和耐藥性分析。進一步采用機器學(xué)習(xí)方法,建立判別分析模型,對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)進行判別分析,尋找MRSA與甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)的差異特征,在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的耐藥菌株差異特征分析做了初步探討,有望為病原菌的快速檢測提供新方法。研究目的:本研究擬構(gòu)建簡便、無標(biāo)記的基于AgNPs~+的SERS檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計分析和機器學(xué)習(xí)方法,用于S.aureus的種屬鑒定、臨床MRSA菌株的判別分析以及篩選MRSA的差異分子,為臨床感染性疾病快速診斷、避免抗生素濫用、減少抗生素耐藥提供新的思路和新的方法。材料與方法:1.不同種類納米材料用于病原菌檢測的SERS效應(yīng)研究(1)合成納米材料,包括金銀納米核殼復(fù)合(gold-silver nano-core shell composite material,AuNR@Ag)材料、金納米三角片-金納米顆粒復(fù)合物(gold nano-triangle-gold nanoparticle composite,TAuNPs-AuNPs)及AgNPs膠體溶液。(2)不同納米材料及其與S.aureus結(jié)合前后的表征,包括紫外-可見光(ultraviolet-visible absorption spectrum,UV-Vis)、掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)、透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)、Zeta電位、粒徑分析、能譜分析的表征(energy dispersive spectrometer analysis,EDS)。(3)驗證不同納米材料檢測病原菌的SERS效應(yīng)。2.基于AgNPs~+的SERS檢測病原菌的方法學(xué)評價(1)基于AgNPs~+的SERS檢測S.aureus的條件優(yōu)化。(2)基于AgNPs~+檢測S.aureus的SERS效應(yīng)驗證。(3)基于AgNPs~+的SERS檢測S.aureus的方法學(xué)評價,包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等方法學(xué)指標(biāo)的評價。3.基于AgNPs~+的SERS檢測技術(shù)用于病原菌的種屬區(qū)分和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的檢測(1)菌株的收集和菌液的制備,包括床菌株的收集、鑒定和藥敏試驗以及標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇。(2)不同種屬病原菌以及臨床MRSA菌株的拉曼光譜檢測。(3)基于多變量統(tǒng)計分析不同種屬病原菌以及MRSA的拉曼光譜數(shù)據(jù)。(4)基于機器學(xué)習(xí)方法,建立和評價MRSA的判別分析模型。研究結(jié)果:1.不同種類納米材料用于病原菌檢測的SERS效應(yīng)研究(1)成功的制備了AuNR@Ag核殼材料、AuNR@Ag SERS基底,以及帶正電的銀納米顆粒(positively charged silver nanoparticles,AgNPs~+)和帶負電的銀納米顆粒(negatively charged silver nanoparticles,AgNPs~-)。(2)AuNR@Ag基底檢測可獲得了細菌的特征譜,但AuNR@Ag基底的空白信號對細菌的特征譜有覆蓋。Q-SERS對拉曼報告基團的增強效應(yīng)顯著,報告基團的特征峰明顯。但Q-SERS基底對于細菌檢測的增強效應(yīng)不顯著。(3)AgNPs~+通過靜電結(jié)合,緊密包裹到細菌表面。AgNPs對于細菌檢測的增強效應(yīng)顯著。AgNPs~+增強效應(yīng)比AgNPs~-顯著。2.基于AgNPs~+的SERS檢測病原菌的方法學(xué)評價(1)實驗條件優(yōu)化為AgNPs~+與S.aureus的孵育時間為30 min,AgNPs~+與S.aureus的體積比為1:1,S.aureus的菌液配置緩沖液為超純水,AgNPs~+的粒徑選取65 nm。(2)成功建立了基于AgNPs~+的SERS檢測方法。驗證了AgNPs~+檢測S.aureus的SERS效應(yīng)。AgNPs~+增強因子達10~7,AgNPs~+在730 cm~(-1)的峰強度比AgNPs~-的強3.4倍。(3)基于AgNPs~+的SERS檢測方法可探測單個S.aureus的拉曼光譜信號。采用分離培養(yǎng)和拉曼光譜的多變量統(tǒng)計可區(qū)分S.aureus與其他屬病原菌。該檢測方法的重復(fù)性在可接受范圍內(nèi),批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為12.7%,批間RSD為14.31%。該方法成功用于臨床樣本中的S.aureus檢測。3.基于AgNPs~+的SERS檢測技術(shù)用于病原菌的種屬區(qū)分和MRSA的檢測(1)細菌與真菌的拉曼光譜峰位置、峰強度差異顯著。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的拉曼光譜的拉曼峰位置、峰強度具有明顯差別。組成分分析(principal component analysis,PCA)或偏最小二乘法判別分析(latent structure discriminant analysis classification,PLS-DA)可區(qū)分不同屬病原菌。正交偏最小二乘法判別分析(latent structure discriminant analysis classification,OPLS-DA)S.aureus與其他屬的差異變量主要位于721-735 cm~(-1)、1316-1322 cm~(-1)、647-656 cm~(-1)、1618-1626 cm~(-1)等拉曼位移處。(2)同屬不同種或不同株之間的拉曼光譜肉眼無法直接區(qū)分。PCA或?qū)哟尉垲惙治?Hierarchical clustering analysis,HCA)可區(qū)分同屬不同種、不同株病原菌的拉曼光譜。PLS-DA分析S.aureus 29213與S.aureus 25923的差異特征主要分布在729-735cm~(-1)和1319-1335 cm~(-1)。(3)MRSA與MSSA的拉曼光譜譜峰的位置、強度和相對強度比例可見差異。MRSA在727-730 cm~(-1)、1322-1325 cm~(-1)拉曼位移處的峰強度相對低,而在1003-1006cm~(-1)、1154-1159 cm~(-1)、1237 cm~(-1)和1518-1521 cm~(-1)的峰強度相對高。(4)PCA不能直接區(qū)分MRSA與MSSA。HCA、PLS-DA可區(qū)分兩者。MRSA的不同組R1、R2、R3、R4相互之間也可區(qū)分。OPLS-DA分析MRSA與MSSA拉曼光譜的差異變量主要位于513-519 cm~(-1)、727-732 cm~(-1)、1147-1152 cm~(-1)、1513-1521 cm~(-1)。多變量統(tǒng)計分析模型的R~2X(cum)為0.87,R~2Y(cum)為0.712,Q~2(cum)為0.73。(5)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類器對于MRSA和MSSA的判別分析受試者曲線下面積(area under the curve,AUC)值為0.986,精確率為0.960,召回率為0.959,初步選取神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為S.aureus臨床耐藥菌株的分類模型。機器學(xué)習(xí)方法篩選的MRSA和MSSA差異特征主要為721-727 cm~(-1)、697.821 cm~(-1)、960-972 cm~(-1)、1314.27 cm~(-1)、750-756 cm~(-1)、510.72 cm~(-1),可與OPLS-DA分析的結(jié)果互補。研究結(jié)論:1.本研究系統(tǒng)性的評估了不同種類納米材料用于病原菌無標(biāo)記檢測的SERS效應(yīng),篩選AgNPs~+作為檢測病原菌的增強材料,其增強因子達10~7。建立并評價了基于AgNPs~+的SERS檢測方法,該研究方法可探測到單個細菌的拉曼信號。該檢測方法的批內(nèi)RSD為12.7%,批間RSD為14.31%。通過多變量統(tǒng)計分析病原菌的拉曼光譜,初步區(qū)分不同屬、不同種、不同株的病原菌。進一步對臨床菌株MRSA與MSSA的光譜數(shù)據(jù)進行區(qū)分,多變量統(tǒng)計分析模型的R~2X(cum)為0.87,R~2Y(cum)為0.712,Q~2(cum)為0.73。通過機器學(xué)習(xí)方法,篩選神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為MRSA與MSSA的分類器,預(yù)測模型的受試者曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)的AUC值為98.6%,對樣本預(yù)測的符合率達95.9%,基于OPLS-DA與機器學(xué)習(xí)方法篩選了MRSA與MSSA的差異特征,兩種方法篩選的結(jié)果可相互補充。2.本研究基于AgNPs~+膠體溶液的SERS的檢測方法,結(jié)合多變量統(tǒng)計分析和機器學(xué)習(xí)方法,一方面,有望為病原菌的快速鑒定和耐藥性分析提供了新方法。另一方面,初步分析差異特征,為臨床耐藥菌株差異分子的歸屬、差異分子的生物學(xué)解釋提供數(shù)據(jù)支持。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 1-1. 細菌感染的實驗室檢驗方法速檢測病原菌的研究現(xiàn)狀器具有制備成本低、操作簡便、檢測快速、高靈敏度、強點，其在生物醫(yī)學(xué)檢測、食品安全、藥物檢驗等領(lǐng)域具有幾十年，研究者在生物傳感器應(yīng)用于病原菌快速檢測方面器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究旨在滿足臨床病原菌早期、物傳感器可以定義為一種分析檢測設(shè)備，將生物分子響應(yīng)等可探測的信號。生物傳感器主要有生物識別元件和信號轉(zhuǎn)包括抗體，酶、核酸、適配體、噬菌體、細胞器、微生物件可特異識別目標(biāo)生物分子。三種主要的生物識別元件是元件的成功組裝是保障生物傳感器特異性的關(guān)鍵。生物元

. 生物傳感器的組成和分類。包括電化學(xué)（Electrochemical）、光學(xué)（Optical）和基（Mass-based）等不同種類傳感器[7]、光譜學(xué)技術(shù)在病原菌檢測應(yīng)用方面的研究現(xiàn)狀學(xué)生物傳感器在病原菌檢測應(yīng)用領(lǐng)域已有廣泛的報道。由于光學(xué)生物傳、特異性和相對快速的檢測的優(yōu)點而受到極大關(guān)注。 除此之外，通過光換能器對生物樣本檢測已實現(xiàn)可視化檢測�；�于光學(xué)的檢測技術(shù)主要分為標(biāo)記和有標(biāo)記檢測。根據(jù)檢測原理，光學(xué)生物傳感器可進一步分類為表（surface plasmon resonance, SPR）、比色傳感器、SERS、熒光和化學(xué)發(fā)是基于吸收，反射，折射和色散等光學(xué)參數(shù)而獲得。不同種類光學(xué)傳感eus 檢測的靈敏度、線性范圍如表 1-4 所示�；�于光學(xué)檢測病原菌的方法中，SPR、比色、熒光等檢測方法研究最為廣由入射光在正介電常數(shù)材料和負介電常數(shù)材料之間的界面產(chǎn)生的振蕩現(xiàn)于共振角的變化導(dǎo)致吸收光波長的變化。當(dāng)目標(biāo)分析物結(jié)合在傳感器表面

圖 2-1. 1990 年 1 月到 2019 年 1 月在 pubmed 發(fā)表的 SERS 相關(guān)文獻統(tǒng)計a）局部表面等離子共振（LSPR）效應(yīng)的圖示；（b）真空中半徑為 35 納米消光效率[33]S 檢測包括直接檢測和間接檢測兩種方法，如圖 2-3 所示[34]。通過
【參考文獻】

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本文編號：2893305