目的:目前,抗生素的濫用使得多重耐藥菌正日益增多,威脅著人類的健康。多重耐藥的傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)和碳青霉烯類耐藥腸桿菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)是可以引起人類嚴(yán)重感染甚至致命的兩類細(xì)菌,了解它們的耐藥機(jī)制對(duì)臨床感染的預(yù)防和監(jiān)控具有十分重要的意義。本文首先圍繞傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥調(diào)節(jié)子Ram R及Ram A在傷寒沙門菌中的功能展開研究,旨在探究?jī)烧咴趥抽T菌耐受氨芐西林中的作用。另外,由于近年來碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛使用,使得CRE菌株在全球蔓延,本文擬通過分析中國(guó)東部蘇州地區(qū)的CRE分子流行病學(xué)特征,為本地區(qū)CRE感染的治療和監(jiān)控提供有力的理論依據(jù)。近年來,質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn)并蔓延至CRE菌株預(yù)示著泛耐藥菌的出現(xiàn),引起了全球關(guān)注,本文擬分析來自我國(guó)六個(gè)不同地區(qū)的CRE菌株攜帶mcr-1的分子特性及其表達(dá)特征,為mcr-1耐藥機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。方法:一、傷寒沙門菌中ramR及ramA對(duì)氨芐西林的耐藥調(diào)控功能研究1、ramR基因缺陷株的制備:PCR擴(kuò)增ramR上下游基因片段F1、F2,再將F1和F2連接成ramR的缺損片段F3,將F3與自殺質(zhì)粒p GMB151連接以構(gòu)建重組載體,并電轉(zhuǎn)至S.Typhi野生株GIFU10007,利用自殺質(zhì)粒上sac B基因特性篩選ramR基因缺陷變異株(ΔramR)。2、ramA基因高表達(dá)株及空質(zhì)粒對(duì)照株的制備:擴(kuò)增ramA基因片段并克隆至高表達(dá)質(zhì)粒p BAD33中,分別將重組質(zhì)粒p BAD33-ramA和空質(zhì)粒p BAD33電轉(zhuǎn)至GIFU10007,即分別為ramA高表達(dá)株GIFU10007(p BAD33ramA)和空質(zhì)粒對(duì)照株GIFU10007(p BAD33)。3、氨芐西林壓力下ΔramR和GIFU10007(p BAD33ramA)中ramA的表達(dá)分析:分別提取傷寒沙門菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨芐西林應(yīng)激30min后的總RNA,利用q RT-PCR技術(shù)測(cè)定各菌株中ramA的表達(dá)水平,并比較它們的表達(dá)差異。4、氨芐西林應(yīng)激下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定:分別測(cè)定傷寒沙門菌GIFU10007、ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)和GIFU10007(p BAD33)在氨芐西林應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)曲線,比較其生長(zhǎng)差異,即對(duì)氨芐西林的耐受度差異。二、蘇州地區(qū)CRE臨床菌株的耐藥分子流行病學(xué)分析1、菌株鑒定和藥敏分析:用Phoenix-100(BD)全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)收集的CRE菌株進(jìn)行菌種鑒定和藥敏分析,并通過PCR擴(kuò)增16S r RNA和測(cè)序比對(duì)進(jìn)行菌種驗(yàn)證。2、耐藥基因的篩選:采用PCR法篩選碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、bla IMP、blaOXA-48)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)、Amp C頭孢菌素酶基因(blaCMY、blaACT、blaDHA)和孔道蛋白基因(omp K35/omp F、omp K36/omp C)等,結(jié)果經(jīng)測(cè)序鑒定。3、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST):PCR擴(kuò)增大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬的看家基因,并進(jìn)行雙向測(cè)序,將基因序列上傳至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站后獲得Sequence Type(ST)分型結(jié)果。4、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分析:經(jīng)上述MLST分析未獲得ST分型的菌株,利用PFGE技術(shù)進(jìn)行分析,調(diào)查CRE臨床分離株的流行病學(xué)相關(guān)性。5、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):將受體菌和產(chǎn)碳青霉烯酶的供體菌混合培養(yǎng)進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn),再通過PCR法篩選出陽(yáng)性接合轉(zhuǎn)移子。6、S1-PFGE:挑取攜帶blaKPC的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行S1-PFGE實(shí)驗(yàn),分析blaKPC整合質(zhì)粒的分子特征。7、質(zhì)粒序列分析:挑取具有代表性的碳青霉烯酶基因整合的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行質(zhì)粒序列測(cè)定分析。三、多地區(qū)CRE菌株合并多粘菌素耐藥基因mcr-1的相關(guān)研究1、耐藥基因分析:首先PCR篩選多地區(qū)收集的CRE臨床分離株中粘菌素耐藥基因mcr-1,然后對(duì)mcr-1陽(yáng)性的菌株進(jìn)行碳青霉烯酶基因等其它耐藥基因分析。2、MLST分析:同上述2.3方法,對(duì)攜帶mcr-1的CRE菌株進(jìn)行MLST分析。3、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):以mcr-1陽(yáng)性的CRE菌株為供體菌,方法同2.5。4、藥敏試驗(yàn):用Phoenix-100(BD)對(duì)mcr-1陽(yáng)性的CRE菌株及其接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行藥敏分析,分析其抗性譜特征。5、基于PCR的質(zhì)粒復(fù)制子分型(PCR-based Replicon Typing,PBRT):根據(jù)質(zhì)粒復(fù)制子的不同類型,可以將質(zhì)粒分為18個(gè)不相容質(zhì)粒群和Inc X、Inc I2,通過PCR擴(kuò)增對(duì)攜帶mcr-1的質(zhì)粒進(jìn)行分型。6、質(zhì)粒序列測(cè)定和全基因組序列測(cè)定:提取質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子中不同類型的質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒序列測(cè)定,無(wú)法獲得接合轉(zhuǎn)移子的mcr-1陽(yáng)性的臨床菌進(jìn)行全基因組序列分析。7、臨床菌株中mcr-1的表達(dá)水平分析:在無(wú)任何應(yīng)激條件下提取各CRE臨床菌的總RNA,采用絕對(duì)定量法進(jìn)行熒光定量PCR,分析各CRE菌株中mcr-1的基礎(chǔ)表達(dá)水平。8、多粘菌素應(yīng)激下臨床菌株中mcr-1的表達(dá)水平變化分析:用多粘菌素分別刺激20min和120min,采用絕對(duì)定量熒光PCR法測(cè)定mcr-1的表達(dá)量,分析不同菌株在應(yīng)激不同時(shí)刻時(shí)mcr-1的表達(dá)差異。9、多粘菌素應(yīng)激下接合轉(zhuǎn)移子中mcr-1的表達(dá)水平變化分析:用多粘菌素分別應(yīng)激mcr-1接合轉(zhuǎn)移子20min和120min,進(jìn)行絕對(duì)定量熒光PCR,分析在相同遺傳背景中mcr-1的表達(dá)變化。10、含mcr-1臨床菌株及其接合轉(zhuǎn)移子的多粘菌素MIC測(cè)定:采用常量肉湯稀釋法進(jìn)行多粘菌素MIC測(cè)定,分析多粘菌素的MIC值與mcr-1的表達(dá)水平是否相關(guān)。結(jié)果:一、傷寒沙門菌中ramR及ramA對(duì)氨芐西林的耐藥調(diào)控功能研究1、成功制備傷寒沙門菌ΔramR、GIFU10007(p BAD33ramA)及GIFU10007(p BAD33)。2、在氨芐西林壓力下,GIFU10007(p BAD33ramA)的ramA表達(dá)量是GIFU10007(p BAD33)的43倍,而ΔramR和GIFU10007中ramA的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、氨芐西林應(yīng)壓力下,GIFU10007(p BAD33ramA)的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于GIFU10007(p BAD33),ΔramR和GIFU10007生長(zhǎng)速度沒有差異。二、蘇州地區(qū)CRE臨床菌株的耐藥分子流行病學(xué)分析1、本研究共收集到蘇州CRE70株,其中40株肺炎克雷伯菌分屬于至少10種不同的STs,以ST11最常見;2株產(chǎn)酸克雷伯菌屬于不同的STs;7株腸桿菌屬細(xì)菌檢出3個(gè)不同的STs;3株大腸桿菌的STs各不相同;15株粘質(zhì)沙雷菌可分成兩種主要的PFGE型帶,而2株解鳥氨酸克雷伯菌的PFGE帶型各不相同。共鑒定出52株產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌(Carbapenem-Producing Enterobacteriaceae,CPE),含bla KPC-2(n=42)、blaKPC-3(n=1)、blaNDM-1(n=6)、blaNDM-5(n=1)、blaIMP-4(n=3)和blaVIM(n=2);54株CRE產(chǎn)ESBLs和/或Amp C,包括blaTEM(n=42)、blaSHV(n=26)、bla CTX-M(n=50)、blaDHA(n=19)、blaCMY(n=2)和blaACT(n=2);20株CRE的孔蛋白基因發(fā)生了突變;2、本實(shí)驗(yàn)獲得了15株blaKPC陽(yáng)性的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移子,包括blaKPC-2和blaKPC-3的接合轉(zhuǎn)移子,以及p NDM_E600、p IMP_E600和p VIM_E600接合轉(zhuǎn)移子。其中攜帶blaKPC的質(zhì)粒至少有3種,其長(zhǎng)度分別為~70kb、~95kb、~130kb、~150kb,其中最多的是~95kb長(zhǎng)度的質(zhì)粒,為Inc F質(zhì)粒,攜帶blaNDM-1、blaNDM-5、blaIMP-4和blaVIM的質(zhì)粒分別為Inc A/C、Inc X3、Inc H和Inc I1質(zhì)粒。blaKPC-2由NTEKPC-1a p Kp048樣元件所攜帶,而blaKPC-3由一種新型的NTEKPC-II元件所攜帶,并在blaKPC-3上游94bp處插入了blaTEM。blaNDM-1鑲嵌于1類整合子中,從而形成了一種新型的移動(dòng)元件。三、多地區(qū)CRE菌株合并多粘菌素耐藥基因mcr-1的相關(guān)研究1、從多地區(qū)CRE菌株中獲得5株mcr-1陽(yáng)性的大腸埃希菌,分別為蘇州的SZ01(ST2448)、SZ02(ST2085)、成都的CDA6(ST167)、北京的BJ10(ST156)、BJ13(ST457),2株含mcr-1的肺炎克雷伯菌,即蘇州的SZ03(ST25)、SZ04(ST25),及其接合轉(zhuǎn)移子SZ01-mcr-1-E600、SZ02-mcr-1-E600、CDA6-mcr-1-J53、BJ13-mcr-1-J53、SZ03-mcr-1-J53、SZ04-mcr-1-J53,但未獲得BJ10的接合轉(zhuǎn)移子。SZ01、CDA6、SZ03和SZ04中mcr-1整合的質(zhì)粒均為Inc X4質(zhì)粒,即p MCR1_Inc X4;SZ02和BJ13中攜帶mcr-1的質(zhì)粒均為Inc I2,即p MCR1_Inc I2。所有攜帶mcr-1的質(zhì)粒均有相同的2.6 kb長(zhǎng)的mcr-1-pap2基因簇結(jié)構(gòu);E.coli BJ10中mcr-1位于染色體內(nèi)Tn9樣復(fù)合轉(zhuǎn)座子中(暫命名為Tn Apl)。2、攜帶多粘菌素耐藥基因mcr-1的CRE臨床分離株,在沒有多粘菌素作用的條件下,p MCR1_Inc X4攜帶的mcr-1表達(dá)水平介于1.81×10-5至1.05×10-4(pmol/μg總RNA)之間,p MCR1_Inc I2的mcr-1表達(dá)水平分別為5.27×10-5(SZ02)和2.58×10-5(BJ13)(pmol/μg總RNA)。另外,BJ10中染色體mcr-1的表達(dá)量為5.49×10-5(pmol/μg總RNA)。3、攜帶p MCR1_Inc X4的CRE臨床菌株在多粘菌素作用20min和120min后,其表達(dá)量分別增加了2倍和4倍;其中,特別是的SZ01在多粘菌素作用20min后其表達(dá)降低,但在作用120min后其表達(dá)又恢復(fù)到了基線水平;SZ02、BJ13中的p MCR1_Inc I2和BJ10的染色體中mcr-1的表達(dá)量在20min和120min后均保持在基線水平。4、p MCR1_Inc X4和p MCR1_Inc I2在大腸桿菌E600中的mcr-1表達(dá)水平相似,并在粘菌素刺激20min后降低,而120分鐘后p MCR1_Inc X4中的mcr-1表達(dá)上調(diào),而p MCR1_Inc I2中的mcr-1下調(diào)。結(jié)論:1、傷寒沙門菌中ramA高表達(dá)時(shí)可增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)氨芐西林的抗性;ramR既不抑制ramA的轉(zhuǎn)錄表達(dá),也不參與ramA對(duì)氨芐西林的耐藥調(diào)控過程,這點(diǎn)不同于其他細(xì)菌。2、蘇州地區(qū)CRE菌株的細(xì)菌種類和STs較豐富,且其耐藥機(jī)制如碳青霉烯酶、ESBLs、Amp C、突變孔蛋白、質(zhì)粒等具有顯著的多樣性。3、攜帶mcr-1的CRE菌株已開始在中國(guó)不同地區(qū)的醫(yī)院傳播,且本研究首次報(bào)道了mcr-1整合于染色體的CRE,同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有攜帶mcr-1的質(zhì)粒均含有長(zhǎng)為2.6 kb的mcr-1-pap2基因簇結(jié)構(gòu)。此外,在多粘菌素應(yīng)激下,mcr-1在不同質(zhì)粒和不同遺傳背景的細(xì)菌宿主中具有不同的表達(dá)特征,提示其表達(dá)調(diào)控較復(fù)雜,有待進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：
9.1絕對(duì)定量PCR中mcr-1的融解峰Fig3.3.9.1Themeltpeakofmcr-1inabsolutequantitativePCR
認(rèn)為 P<0.5 時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果如圖3.3.9.3 所示，在兩株肺炎克雷伯菌 SZ03 和 SZ04（均為 ST25）以及兩株大腸埃希菌CDA6（ST167）和 SZ01（ST2448）的質(zhì)粒 pMCR1_IncX4 中，mcr-1 表達(dá)水平在 1.81×10-5~1.05×10-4（pmol/μg 總 RNA）之間，其中表達(dá)水平最高的是 CDA6。E. coli SZ02（ST2085）和 BJ13（ST457）中 pMCR1_IncI2 的 mcr-1 表達(dá)水平分別為 5.27×10-5和 2.58×10-5（pmol/μg 總 RNA）。E. coli BJ10（ST156）的染色體 mcr-1 的表達(dá)水平58
認(rèn)為 P<0.5 時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果如圖3.3.9.3 所示，在兩株肺炎克雷伯菌 SZ03 和 SZ04（均為 ST25）以及兩株大腸埃希菌CDA6（ST167）和 SZ01（ST2448）的質(zhì)粒 pMCR1_IncX4 中，mcr-1 表達(dá)水平在 1.81×10-5~1.05×10-4（pmol/μg 總 RNA）之間，其中表達(dá)水平最高的是 CDA6。E. coli SZ02（ST2085）和 BJ13（ST457）中 pMCR1_IncI2 的 mcr-1 表達(dá)水平分別為 5.27×10-5和 2.58×10-5（pmol/μg 總 RNA）。E. coli BJ10（ST156）的染色體 mcr-1 的表達(dá)水平58
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本文編號(hào)：
2891988
