發(fā)布時間：2018-01-09 09:16

  本文關鍵詞：間歇性堿刺激對高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響及機制研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:維持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者的全因死亡率逐年上升,其中心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一,而血管鈣化是其最常見的病理表現(xiàn),據(jù)統(tǒng)計表明,血管鈣化導致的死亡率約占MHD患者總病死率的30%左右。影響MHD患者血管鈣化的危險因素眾多,如高齡、貧血、高脂血癥、高磷血癥以及長透析齡等危險因素。但傳統(tǒng)危險因素已不能完全解釋MHD患者血管鈣化,因此,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化,堿性環(huán)境促進VSMCs鈣化。然而,間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及其可能的機制尚未完全明確,因此本研究將通過模擬MHD患者體內(nèi)特有的p H變化規(guī)律,探討間歇性堿刺激對VSMCs鈣化的影響及可能機制。方法:1 VSMCs的原代培養(yǎng)及實驗分組將血管外膜輕輕剝除,縱行剖開血管,用無菌紗布輕輕擦除內(nèi)膜,應用組織貼壁法進行VSMCs原代培養(yǎng),并進行鑒定。經(jīng)自然純化后,選取生長良好的4代細胞進行實驗。采用隨機數(shù)字表法,將VSMCs隨機分為6組:正常對照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預組。干預4 d后,提取各組細胞m RNA和蛋白,進行RNA及蛋白水平檢測,干預14 d后進行鈣化檢測。2血管環(huán)的培養(yǎng)及實驗分組體外分離大鼠胸主動脈血管環(huán),采用隨機數(shù)字表法,將VSMCs隨機分為6組:正常對照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預組。干預14天后,用組織免疫組化方法檢測LTCCβ3、SM22α和Runx2表達情況,并進行鈣化檢測。3 RT-PCR和Western印跡法檢測各目的基因及蛋白的表達細胞干預4天后,分別提取正常對照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預組m RNA和蛋白,用RT-PCR和Western Blot方法測定L型鈣通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亞基和Runx2的表達情況。4免疫組化方法檢測血管環(huán)各目的蛋白表達取石蠟切片(3μm)常規(guī)脫蠟,用EDTA高壓鍋煮沸抗原修復,3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,山羊血清封閉,滴加一抗:LTCCβ3亞基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100),放入4℃過夜;滴加第二代生物素標記的二抗工作液和辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,DAB顯色,顯微鏡下觀察,蒸餾水終止反應,蘇木素復染,明顯棕黃色顆粒為陽性,不著色為陰性。5 VSMCs鈣化情況及ALP活性測定VSMCs鈣含量測定:細胞干預14天,用BCA法測定細胞鈣含量,鈣含量(mg/g)用蛋白含量校準。茜素紅染色:細胞干預14天,加入茜素紅染液,放入37℃溫箱賦育30 min,橘紅色為鈣鹽沉積。ALP活性測定:使用ALP活性試劑盒測定其活性,結(jié)果用蛋白含量校準。6血管環(huán)鈣化情況測定血管環(huán)鈣含量測定:血管環(huán)干預14天后用鄰甲酚酞絡合酮比色法測定鈣含量,以mg/g為單位。硝酸銀鈣化染色:血管環(huán)干預14天后常規(guī)脫蠟、脫水,滴加5%硝酸銀溶液,紫外光照射60 min,5%硫代硫酸鈉溶液定影,堿性品紅復染,鈣鹽沉積處被染為黑褐色。7 VSMCs鈣離子濃度測定細胞干預4天后,使用鈣離子探針技術檢測VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。8統(tǒng)計學處理應用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)應用均數(shù)±標準差表示,多組間均數(shù)差異比較應用單因素方差分析(ANOVA),組間均數(shù)兩兩比較應用SNK檢驗,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs鈣化影響VSMCs茜素紅染色與鈣含量測定結(jié)果一致,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組鈣鹽沉積減少(P0.05)。2間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)鈣化影響血管環(huán)VonKossa染色與鈣含量測定結(jié)果一致,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組鈣化結(jié)節(jié)減少(P0.05)。3間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs Runx2表達和ALP活性的影響RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組Runx2表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組Runx2表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組Runx2表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組Runx2表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組Runx2表達水平降低(P0.05)。ALP活性測定結(jié)果顯示,間歇性堿刺激增加ALP活性(P0.05),維拉帕米抑制ALP活性(P0.05)。4間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)Runx2和SM22α表達的影響免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組Runx2表達水平增高(P0.05),SM22α表達水平降低(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組Runx2表達水平增高(P0.05),SM22α表達水平降低(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組Runx2表達水平增高(P0.05),SM22α表達水平降低(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組Runx2表達水平增高(P0.05),SM22α表達水平降低(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組Runx2表達水平降低(P0.05),SM22α表達水平增高(P0.05)。5間歇性堿刺激對高磷誘導的VSMCs的LTCCβ3亞基表達及鈣離子內(nèi)流效應的影響RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組LTCCβ3亞基表達水平降低(P0.05)。熒光顯色結(jié)果顯示,間歇性堿刺激增加VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強度(P0.05),維拉帕米抑制減少VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強度(P0.05)。6間歇性堿刺激對高磷誘導的血管環(huán)LTCCβ3亞基表達的影響免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組相比,高磷+p H7.4組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組LTCCβ3亞基表達水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預組LTCCβ3亞基表達水平降低(P0.05)。結(jié)論:間歇性堿刺激促進高磷誘導的VSMCs的血管鈣化,其機制可能與間歇性堿刺激上調(diào)L型鈣通道β3亞基表達,進而增加鈣離子內(nèi)流,促進VSMCs成骨成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化有關。
[Abstract]:Objective : To study the effect and possible mechanism of intermittent base stimulation on calcification in MHD patients . Immunohistochemical method was used to detect the expression of 尾 - 3 subunit and Runx2 in normal control group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . 5 group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . The calcium ion concentration in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the normal control group , the calcium salt deposition increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the calcium salt deposition in high P + p H7 group increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with normal control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of lt尾3 subunit in high P + p H7 group increased significantly ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R459.5;R54

【參考文獻】

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1 張勝雷;徐金升;郭利萍;白亞玲;張俊霞;崔立文;張慧然;;酸性環(huán)境對慢性腎功能衰竭大鼠血管中膜鈣化的影響及其機制[J];中國動脈硬化雜志;2016年12期

2 張勝雷;徐金升;楊碩;白亞玲;張俊霞;崔立文;俞U_遙;;堿性環(huán)境對慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響[J];臨床心血管病雜志;2016年04期

3 張俊霞;徐金升;馮雨;白亞玲;張勝雷;崔立文;張慧然;;酸性環(huán)境對高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響及機制研究[J];中國心血管雜志;2015年06期

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本文編號：1400822