發(fā)布時(shí)間：2018-01-09 09:16

  本文關(guān)鍵詞：間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:維持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者的全因死亡率逐年上升,其中心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一,而血管鈣化是其最常見的病理表現(xiàn),據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,血管鈣化導(dǎo)致的死亡率約占MHD患者總病死率的30%左右。影響MHD患者血管鈣化的危險(xiǎn)因素眾多,如高齡、貧血、高脂血癥、高磷血癥以及長(zhǎng)透析齡等危險(xiǎn)因素。但傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素已不能完全解釋MHD患者血管鈣化,因此,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),酸性環(huán)境抑制VSMCs鈣化,堿性環(huán)境促進(jìn)VSMCs鈣化。然而,間歇性堿刺激對(duì)VSMCs鈣化的影響及其可能的機(jī)制尚未完全明確,因此本研究將通過(guò)模擬MHD患者體內(nèi)特有的p H變化規(guī)律,探討間歇性堿刺激對(duì)VSMCs鈣化的影響及可能機(jī)制。方法:1 VSMCs的原代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組將血管外膜輕輕剝除,縱行剖開血管,用無(wú)菌紗布輕輕擦除內(nèi)膜,應(yīng)用組織貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng),并進(jìn)行鑒定。經(jīng)自然純化后,選取生長(zhǎng)良好的4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法,將VSMCs隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)4 d后,提取各組細(xì)胞m RNA和蛋白,進(jìn)行RNA及蛋白水平檢測(cè),干預(yù)14 d后進(jìn)行鈣化檢測(cè)。2血管環(huán)的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組體外分離大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán),采用隨機(jī)數(shù)字表法,將VSMCs隨機(jī)分為6組:正常對(duì)照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預(yù)組。干預(yù)14天后,用組織免疫組化方法檢測(cè)LTCCβ3、SM22α和Runx2表達(dá)情況,并進(jìn)行鈣化檢測(cè)。3 RT-PCR和Western印跡法檢測(cè)各目的基因及蛋白的表達(dá)細(xì)胞干預(yù)4天后,分別提取正常對(duì)照組、高磷+p H7.4組、高磷+p H7.5組、高磷+p H7.6組、高磷+p H7.7組及維拉帕米干預(yù)組m RNA和蛋白,用RT-PCR和Western Blot方法測(cè)定L型鈣通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亞基和Runx2的表達(dá)情況。4免疫組化方法檢測(cè)血管環(huán)各目的蛋白表達(dá)取石蠟切片(3μm)常規(guī)脫蠟,用EDTA高壓鍋煮沸抗原修復(fù),3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,山羊血清封閉,滴加一抗:LTCCβ3亞基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100),放入4℃過(guò)夜;滴加第二代生物素標(biāo)記的二抗工作液和辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,DAB顯色,顯微鏡下觀察,蒸餾水終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染,明顯棕黃色顆粒為陽(yáng)性,不著色為陰性。5 VSMCs鈣化情況及ALP活性測(cè)定VSMCs鈣含量測(cè)定:細(xì)胞干預(yù)14天,用BCA法測(cè)定細(xì)胞鈣含量,鈣含量(mg/g)用蛋白含量校準(zhǔn)。茜素紅染色:細(xì)胞干預(yù)14天,加入茜素紅染液,放入37℃溫箱賦育30 min,橘紅色為鈣鹽沉積。ALP活性測(cè)定:使用ALP活性試劑盒測(cè)定其活性,結(jié)果用蛋白含量校準(zhǔn)。6血管環(huán)鈣化情況測(cè)定血管環(huán)鈣含量測(cè)定:血管環(huán)干預(yù)14天后用鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定鈣含量,以mg/g為單位。硝酸銀鈣化染色:血管環(huán)干預(yù)14天后常規(guī)脫蠟、脫水,滴加5%硝酸銀溶液,紫外光照射60 min,5%硫代硫酸鈉溶液定影,堿性品紅復(fù)染,鈣鹽沉積處被染為黑褐色。7 VSMCs鈣離子濃度測(cè)定細(xì)胞干預(yù)4天后,使用鈣離子探針技術(shù)檢測(cè)VSMCs內(nèi)鈣離子濃度。8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)差異比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化影響VSMCs茜素紅染色與鈣含量測(cè)定結(jié)果一致,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組鈣鹽沉積增多(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組鈣鹽沉積減少(P0.05)。2間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)鈣化影響血管環(huán)VonKossa染色與鈣含量測(cè)定結(jié)果一致,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組鈣化結(jié)節(jié)增多(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組鈣化結(jié)節(jié)減少(P0.05)。3間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs Runx2表達(dá)和ALP活性的影響RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P0.05)。ALP活性測(cè)定結(jié)果顯示,間歇性堿刺激增加ALP活性(P0.05),維拉帕米抑制ALP活性(P0.05)。4間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)Runx2和SM22α表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組Runx2表達(dá)水平增高(P0.05),SM22α表達(dá)水平降低(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組Runx2表達(dá)水平降低(P0.05),SM22α表達(dá)水平增高(P0.05)。5間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的VSMCs的LTCCβ3亞基表達(dá)及鈣離子內(nèi)流效應(yīng)的影響RT-PCR和Western-blot結(jié)果均顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P0.05)。熒光顯色結(jié)果顯示,間歇性堿刺激增加VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P0.05),維拉帕米抑制減少VSMCs內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度(P0.05)。6間歇性堿刺激對(duì)高磷誘導(dǎo)的血管環(huán)LTCCβ3亞基表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,高磷+p H7.4組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.4組相比,高磷+p H7.5組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.5組相比,高磷+p H7.6組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.6組相比,高磷+p H7.7組LTCCβ3亞基表達(dá)水平增高(P0.05);與高磷+p H7.7組相比,維拉帕米干預(yù)組LTCCβ3亞基表達(dá)水平降低(P0.05)。結(jié)論:間歇性堿刺激促進(jìn)高磷誘導(dǎo)的VSMCs的血管鈣化,其機(jī)制可能與間歇性堿刺激上調(diào)L型鈣通道β3亞基表達(dá),進(jìn)而增加鈣離子內(nèi)流,促進(jìn)VSMCs成骨成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。
[Abstract]:Objective : To study the effect and possible mechanism of intermittent base stimulation on calcification in MHD patients . Immunohistochemical method was used to detect the expression of 尾 - 3 subunit and Runx2 in normal control group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . 5 group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . The calcium ion concentration in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the normal control group , the calcium salt deposition increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the calcium salt deposition in high P + p H7 group increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with normal control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of lt尾3 subunit in high P + p H7 group increased significantly ( P0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R459.5;R54

【參考文獻(xiàn)】

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1 張勝雷;徐金升;郭利萍;白亞玲;張俊霞;崔立文;張慧然;;酸性環(huán)境對(duì)慢性腎功能衰竭大鼠血管中膜鈣化的影響及其機(jī)制[J];中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志;2016年12期

2 張勝雷;徐金升;楊碩;白亞玲;張俊霞;崔立文;俞U_遙;;堿性環(huán)境對(duì)慢性腎衰竭大鼠血管鈣化的影響[J];臨床心血管病雜志;2016年04期

3 張俊霞;徐金升;馮雨;白亞玲;張勝雷;崔立文;張慧然;;酸性環(huán)境對(duì)高磷誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及機(jī)制研究[J];中國(guó)心血管雜志;2015年06期

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本文編號(hào)：1400822