發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 14:39

【摘要】：癌癥,即惡性腫瘤嚴(yán)重地威脅著人類的健康與壽命,是疾病死亡的重要原因,而相關(guān)癌癥標(biāo)志物的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)為癌癥的早期診斷提供了重要的方法和思路。核酸標(biāo)志物(DNA和RNA)是當(dāng)前體外診斷的主要目標(biāo)分子之一。傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法包括微陣列法、PCR法、原位雜交法等,雖然這些方法能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的準(zhǔn)確檢測(cè),但其需要精密昂貴的儀器,專業(yè)的操作人員,復(fù)雜的操作步驟等,限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。因此,設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)便攜式生物傳感器并用于核酸的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)是非常必要的,在疾病診斷和臨床應(yīng)用中具有重要的意義。本論文致力于核酸現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)新方法的開(kāi)發(fā)研究,通過(guò)利用簡(jiǎn)單易得的材料、便攜式分析儀等,構(gòu)建了以下幾種便攜式生物傳感器:1.在棉線上構(gòu)建了基于溫度動(dòng)態(tài)響應(yīng)的超親水-疏水圖案,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了便攜式核酸傳感器用于DNA的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在該傳感器中,利用形態(tài)隨溫度變化的液體蠟在棉線上構(gòu)建了超親水-疏水圖案,使檢測(cè)區(qū)被控制在一個(gè)較窄的區(qū)域,使得檢測(cè)信號(hào)更加集中,從而提高檢測(cè)性能。通過(guò)金納米顆粒在檢測(cè)區(qū)的聚集,實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的可視化及定量檢測(cè),其檢測(cè)限可達(dá)0.75 nM。另外,該基于棉線的核酸傳感器相比于傳統(tǒng)的側(cè)流層析試紙,其所需試樣量更少且流速更快,可以縮短檢測(cè)時(shí)間。該傳感器具有簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、檢測(cè)快等優(yōu)點(diǎn),在提升發(fā)展中國(guó)家的健康服務(wù)方面具有巨大的潛力。2.以生物礦化為靈感,合成了DNA-Cu3(PO4)2雜化納米花,合成的雜化納米花具有高穩(wěn)定性、高比表面以及強(qiáng)DNA封裝能力。并以DNA-Cu3(PO4)2雜化納米花為主要組成部分構(gòu)建了microRNA(miRNA)傳感平臺(tái),該傳感平臺(tái)以DNA-Cu3(PO4)2雜化納米花為捕獲劑、棉線為微流控通道以及血糖儀為信號(hào)輸出設(shè)備。該傳感器可實(shí)現(xiàn)miRNA-21的定量檢測(cè),其檢測(cè)限為0.41 nM。此外,該傳感器具有良好的抗干擾能力,可用于細(xì)胞裂解液中miRNA的檢測(cè)。為miRNA的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及臨床應(yīng)用提供了重要的手段。3.構(gòu)建了三維DNA納米機(jī)器,并以熒光信號(hào)和血糖儀信號(hào)為輸出信號(hào),實(shí)現(xiàn)了miRNA的雙模式檢測(cè)。該DNA納米機(jī)器的主體為磁珠,在其上修飾了大量的發(fā)夾探針BHQ-H1-FAM作為DNA軌道分子,miRNA-21作為催化鏈并激活該三維DNA納米機(jī)器,蔗糖酶-H2復(fù)合物則作為輔助鏈,通過(guò)鏈取代反應(yīng)使納米機(jī)器連續(xù)運(yùn)行。當(dāng)存在目標(biāo)miRNA-21時(shí),H1中的熒光恢復(fù),產(chǎn)生熒光信號(hào),蔗糖酶通過(guò)H2被引入磁珠表面,通過(guò)磁分離將其從溶液中分離,分離的蔗糖酶可催化水解蔗糖為葡萄糖,并用便攜式血糖儀進(jìn)行定量。該傳感器具有高靈敏度及良好的特異性,對(duì)于熒光信號(hào)及血糖儀信號(hào),其檢測(cè)限分別為98 pM及60 pM。相比于單模式檢測(cè),該三維DNA納米機(jī)器擁有獨(dú)特的雙信號(hào)輸出,其結(jié)果更為可信,且可滿足實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的不同需求,在疾病診斷及臨床應(yīng)用方面具有巨大的潛力。4.利用二氧化鈦的自清潔性能,構(gòu)建了以二氧化鈦為基底的可再生超浸潤(rùn)生物芯片用于miRNA-141的特異性及定量檢測(cè)。通過(guò)水熱法在氟摻雜氧化錫(FTO)導(dǎo)電玻璃表面合成了二氧化鈦納米線陣列,并在其上構(gòu)建了超親水-超疏水圖案,由于超親水微井與超疏水基底浸潤(rùn)性的差別,分析物易濃縮富集于超親水微井中,實(shí)現(xiàn)了miRNA的靈敏檢測(cè)。此外,由于二氧化鈦的光催化性能,該超浸潤(rùn)生物芯片可通過(guò)紫外光照射使其表面的有機(jī)物發(fā)生降解,從而實(shí)現(xiàn)再生。該再生的基底可重新用于miRNA傳感器的構(gòu)建,且在多個(gè)循環(huán)中得到了一致的檢測(cè)結(jié)果。該研究為可再生生物芯片的構(gòu)建提供了新思路、新方法,并在生物醫(yī)學(xué)診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

ＭｉＲＮＡ是一類內(nèi)源性非編碼的小分子ＲＮＡ，其長(zhǎng)度約為１８－２５個(gè)堿基，逡逑廣泛存在于動(dòng)植物及病毒中，在基因的表達(dá)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。逡逑ｍｉＲＮＡ的合成及作用機(jī)制是一個(gè)十分復(fù)雜的生理過(guò)程［９＿１１］。如圖２－１所示，逡逑首先，ｍｉＲＮＡ在ＲＮＡ聚合酶ＩＩ或ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ的作用下轉(zhuǎn)錄成初級(jí)ｍｉＲＮＡ逡逑（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ），隨后在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)核酸內(nèi)切酶Ｄｒｏｓｈａ的作用形成長(zhǎng)度約為逡逑７０個(gè)堿基的儢環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為前體ｍｉＲＮＡ邋（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ在細(xì)胞逡逑－３邋－逡逑

圖２－２側(cè)流層析試紙的組成及結(jié)構(gòu)。逡逑側(cè)流層析試紙最常見(jiàn)的檢測(cè)原理有兩種：三明治結(jié)構(gòu)檢測(cè)原理和競(jìng)爭(zhēng)檢逡逑測(cè)原理［４８］。逡逑（１）三明治結(jié)構(gòu)檢測(cè)原理逡逑三明治結(jié)構(gòu)檢測(cè)原理一般用于待測(cè)目標(biāo)物擁有多于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的情逡逑況，以抗原為例，該檢測(cè)形式原理如圖２－３Ａ所示，在該檢測(cè)過(guò)程中用到了三逡逑種不同的檢測(cè)抗體。能識(shí)別目標(biāo)抗原的抗體１邋（Ａｂ0首先與標(biāo)記物（ｌａｂｅｌ）逡逑相結(jié)合并固定在層析試紙的結(jié)合墊上。當(dāng)試樣溶液加到試樣墊后，在毛細(xì)作逡逑用下，樣品迅速浸透結(jié)合墊，使ｌａｂｄ－Ａｂ１復(fù)合物重新水化，并隨著試樣溶液逡逑沿吸水墊方向移動(dòng)，若樣品中存在待測(cè)抗原Ａｇ，其就會(huì)與ｌａｂｅｌ－Ａｂｉ復(fù)合物逡逑相結(jié)合，形成ｌａｂｅｌ－Ａｂ＾Ａｇ復(fù)合物。隨后，試樣溶液通過(guò)固相化有捕獲抗體２逡逑（Ａｂ２）的檢測(cè)線時(shí)，由于Ａｂ２與Ａｂ邋１能識(shí)別同一抗原的不同位點(diǎn)，，ｌａｂｅｌ－Ａｂ邋１邋－Ａｇ逡逑被檢測(cè)線上的Ａｂ２捕獲，形成Ｉａｂｅｌ－Ａｂｉ－Ａｇ－Ａｂ２三明治夾心式的復(fù)合體。使逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657;TP212.3

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本文編號(hào)：2604588