發(fā)布時(shí)間：2020-03-25 18:53

【摘要】：保障食品安全和維護(hù)人類(lèi)健康是當(dāng)前熱門(mén)的兩個(gè)話題,其中食源性致病菌污染導(dǎo)致食品安全事件頻發(fā),嚴(yán)重影響了我國(guó)經(jīng)濟(jì)正常發(fā)展和公眾健康,因此建立高靈敏檢測(cè)方法是降低食源性致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)防感染的迫切需要。食源性致病菌毒力基因可提供致病菌毒性以及特定的遺傳信息,識(shí)別致病性基因是識(shí)別樣品中食源性致病菌污染的重要環(huán)節(jié)。本研究擬以食源性致病菌毒力基因和miRNAs為對(duì)象,納米金為基礎(chǔ),制備不同形貌和性能的金納米材料及其組裝體,通過(guò)表面修飾使其具有良好的生物相容性,借助其特殊的光學(xué)效應(yīng)以及良好的導(dǎo)電性,構(gòu)建一系列光學(xué)信號(hào)增強(qiáng)或者電信號(hào)增強(qiáng)的納米核酸傳感器,建立簡(jiǎn)單、安全、可視化的生物傳感檢測(cè)新方法,用于快速靈敏地檢測(cè)食源性致病菌毒力基因,并實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)毒性生物標(biāo)志物miRNAs高靈敏檢測(cè)及可視化,為實(shí)現(xiàn)食源性致病菌快速檢測(cè)以及胞內(nèi)miRNAs的高效識(shí)別奠定基礎(chǔ);基于宿主細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達(dá)量與食源性致病菌污染劑量的關(guān)系,也為建立以敏感細(xì)胞為模型早期篩查食品中潛在致病菌的方法提供新的思路。1.不同縱橫比的金銀核殼納米棒(Gold@silver nanorods,Au@Ag NRs)的可控合成。采用種子生長(zhǎng)法制備了不同縱橫比的Au@Ag NRs,確定合成過(guò)程中硝酸銀、抗壞血酸和金納米棒的最佳加入量。通過(guò)調(diào)控pH值,結(jié)合紫外可見(jiàn)光光譜儀、透射電子顯微鏡、X射線衍射儀探討Au@Ag NRs的生長(zhǎng)機(jī)理。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示pH值調(diào)控表面活性劑CTAB吸附在金納米棒(Gold nanorods,AuNRs)晶面的位置和速率,從而調(diào)控Ag~0吸附在AuNRs表面的位置,由此制備了不同大小和形狀的Au@Ag NRs,為下一階段利用Au@Ag NRs物理化學(xué)性質(zhì)構(gòu)建生物傳感器奠定基礎(chǔ)。2.基于金銀核殼納米棒表面增強(qiáng)熒光(Surface enhanced fluorescence,SEF)傳感器的構(gòu)建。以不同縱橫比的金納米棒為核制備Au@Ag NRs,通過(guò)對(duì)Au@Ag NRs表面修飾莖環(huán)探針和熒光團(tuán)分子Cy3,構(gòu)建Au@Ag NRs表面增強(qiáng)熒光的“ON-OFF”核酸傳感器,實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)大腸桿菌O157:H7毒力基因eae A。對(duì)影響傳感器中熒光團(tuán)分子Cy3熒光強(qiáng)度的因素進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn),當(dāng)選擇金銀核殼納米長(zhǎng)棒,Cy3分子與Au@Ag NRs表面之間的距離為10 nm時(shí),Au@Ag NRs表面增強(qiáng)熒光團(tuán)分子Cy3的熒光強(qiáng)度效果最強(qiáng),有利于提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)eae A基因濃度在1×10~(-17)-1×10~(-11) mol/L之間時(shí),Cy3熒光團(tuán)分子的熒光強(qiáng)度與大腸桿菌O157:H7基因eae A濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=95.97 x+1992(R~2=0.9947),最低檢出限為3.33×10~-1818 mol/L。構(gòu)建的熒光增強(qiáng)核酸傳感器也表現(xiàn)出良好的特異性和重復(fù)性,可以區(qū)分堿基錯(cuò)配序列,回收率在98.36%-101.67%之間。3.基于金納米十字@二硫化鉬(Gold nanocrosses@molybdenum disulfide,AuNCs@MoS_2)異源二聚體增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)便攜式傳感器的構(gòu)建。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)食源性致病菌,將AuNCs@MoS_2異源二聚體修飾在絲網(wǎng)印刷電極(Screen printed electrode,SPE)上,建立了便攜式電化學(xué)傳感器檢測(cè)大腸桿菌O157:H7毒力基因eae A。目的基因eae A引發(fā)由toehold介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)獲得雙鏈DNA H_1/H_2,該雙鏈DNA與AuNCs@MoS_2/SPE上的cDNA結(jié)合,在[Ru(NH_3)_6]~(3+)分子存在的情況下,引起電化學(xué)信號(hào)變化,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測(cè)。通過(guò)toehold介導(dǎo)的DNA鏈置換反應(yīng)、選擇AuNCs@MoS_2修飾電極表面增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào),大大提高了檢測(cè)的靈敏度,當(dāng)eae A濃度在1-10~5 amol/L之間時(shí),其與電流的差值呈線性相關(guān),線性方程為ΔI(μA)=1.61 log[C_(eae A)(amol/L)]+2.02(R~2=0.9974),最低檢出限為0.096 amol/L。構(gòu)建的傳感器特異性良好,可以區(qū)分單堿基錯(cuò)配序列。4.基于金納米棒-金納米十字(Gold nanorod-gold nanocross,AuNR-AuNC)“FRET-SEF”熒光信號(hào)增強(qiáng)檢測(cè)miRNAs探針的構(gòu)建及其胞內(nèi)成像。為實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)毒性評(píng)價(jià)這一目標(biāo),進(jìn)一步構(gòu)建了新型一對(duì)一組裝的AuNR-AuNC二聚體“FRET-SEF”核酸探針,以“OFF-enhanced ON”熒光增強(qiáng)開(kāi)關(guān)檢測(cè)胞外胞內(nèi)生物標(biāo)志物miRNAs。AuNC與Cy5熒光團(tuán)分子之間10 nm的距離,有利于AuNC表面增強(qiáng)Cy5的熒光強(qiáng)度,AuNC與AuNR的側(cè)面組裝,有利于AuNR對(duì)Cy5分子的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,將AuNC與AuNR巧妙結(jié)合構(gòu)建AuNR-AuNC二聚體,充分利用二聚體產(chǎn)生的熒光增強(qiáng)效應(yīng),大大提高了檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)miRNA-21的濃度分別在0.0006-0.0016 fmol/L和0.1-100 fmol/L范圍內(nèi)時(shí),線性方程分別為F=1830.32 logC+6349.27(R~2=0.9901)和F=244.41 logC+1916.10(R~2=0.9984),檢出限可達(dá)0.5 amol/L和0.03 fmol/L,由此證明構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針可精確測(cè)定生物標(biāo)志物miRNA。此外,構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針具有較好的穩(wěn)定性和低毒性,實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)檢測(cè)Hep G2細(xì)胞生物標(biāo)志物miRNA-21,構(gòu)建的AuNR-AuNC二聚體探針也初步實(shí)現(xiàn)了以敏感細(xì)胞為模型評(píng)價(jià)食源性致病菌毒力因子等外源危害的毒性水平。5.基于FDTD Solutions模擬及金納米花@石墨烯量子點(diǎn)(Gold nanoflower@graphene quantum dots,AuNF@GQDs)構(gòu)建彗星式異源二聚體增敏探針實(shí)現(xiàn)miRNA-34a的檢測(cè)和體內(nèi)成像。為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)毒性評(píng)價(jià),構(gòu)建了低毒性彗星式異源二聚體AuNF@GQDs增敏探針,以toehold誘導(dǎo)目標(biāo)鏈miRNA引發(fā)的從熒光信號(hào)FRET“off”到DNA循環(huán)“on”模式的DNA增敏鏈置換反應(yīng),識(shí)別體內(nèi)體外miRNA-34a的表達(dá)量,評(píng)估細(xì)胞的老化程度。根據(jù)FDTD Solutions計(jì)算模擬AuNF與GQDs之間距離為4 nm時(shí),AuNF對(duì)GQDs有很強(qiáng)的FRET效應(yīng),可縮短響應(yīng)時(shí)間,增強(qiáng)消光效率,有利于提高檢測(cè)的靈敏度。MiRNA-34a濃度在0.4-4 fmol/L時(shí),線性方程為Y=1963 x+213,R~2=0.9921,檢出限為0.1 fmol/L,且該探針特異性好,可以區(qū)分一個(gè)堿基錯(cuò)配序列。該低毒性探針同樣也應(yīng)用于生長(zhǎng)因子TGF-β1誘導(dǎo)后的大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)原位成像和檢測(cè)miRNA-34a的表達(dá)量,當(dāng)TGF-β1濃度在5-500 ng/mL之間時(shí),胞內(nèi)熒光強(qiáng)度與TGF-β1濃度的對(duì)數(shù)值呈線性相關(guān),線性方程為y=1.37 x+1.04,R~2=0.9330。此外,構(gòu)建的二聚體AuNF@GQDs增敏探針注射入12月齡的C57BL/6J小鼠左心室中體內(nèi)檢測(cè)miRNA-34a,成功用于評(píng)價(jià)小鼠心臟的老化程度,且該探針對(duì)小鼠沒(méi)有負(fù)面毒性效應(yīng)�？傊�,本論文構(gòu)建的具有各向異性的金銀核殼納米棒以及納米二聚體增強(qiáng)型核酸探針,通過(guò)設(shè)計(jì)探針的形貌和空間分布,發(fā)現(xiàn)熒光和電化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制,應(yīng)用于食源性致病菌毒力基因的高靈敏檢測(cè),對(duì)建立通過(guò)監(jiān)測(cè)食源性致病菌浸染體內(nèi)引起效應(yīng)生物標(biāo)志物表達(dá)水平的變化,從而評(píng)估食源性致病菌的毒性和宿主受感染的程度具有重要意義。
【圖文】：

圖 1-2 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）原理圖Fig.1-2 Outline of the processes involved in the polymerase chain reaction (PCR)由于 PCR 構(gòu)建的方法需要設(shè)計(jì)待測(cè)致病菌對(duì)應(yīng)的探針，，同時(shí)標(biāo)記同位素以及熒光昂貴，為使這些缺點(diǎn)最小化，需要開(kāi)發(fā)新型的成本可控且響應(yīng)迅速的檢測(cè)方法，并

圖 1-3 構(gòu)建選擇性識(shí)別致病菌納米探針原理圖atic representation showing the fabrication of recognition elements o病菌及其毒力基因檢測(cè)的納米材料通常包括金納Ps）、金納米棒（Gold nanorods，AuNRs）、磁納米
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS207.4;TP212;O657.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙垠瑩;;質(zhì)譜法檢測(cè)食源性致病菌技術(shù)研究進(jìn)展[J];化工管理;2018年35期

2 畢紅杰;張玉梅;任海鵬;王春東;盧俊榮;董曉楓;;2016-2017年河北省滄州市食品中食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果及分析[J];醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制;2019年03期

3 郭海艷;;2017年海西州192份食品中食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J];青海醫(yī)藥雜志;2018年10期

4 李夸巧;張?jiān)茓?黃豆;彭麗超;;食品中食源性致病菌污染狀況分析[J];食品安全導(dǎo)刊;2017年33期

5 ;“食源性致病菌”專(zhuān)題征稿函[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2017年12期

6 陳萍;;南平市2014年食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J];中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理;2017年27期

7 ;“食源性致病菌”專(zhuān)題征稿函[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2018年01期

8 林斌;周銀柱;朱彩明;陳艷;;長(zhǎng)沙市2015年食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2017年06期

9 炊慧霞;吳玲玲;邱正勇;張秀麗;;2016年河南省市售動(dòng)物性水產(chǎn)品中食源性致病菌污染狀況調(diào)查[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2018年03期

10 吳科明;李葉青;李林柯;蒙國(guó)偉;劉曉凌;;2014—2016年防城港市食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果[J];職業(yè)與健康;2018年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 唐靚;李躍中;徐水祥;張文元;劉放;王茵;;中國(guó)食品食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果分析與檢測(cè)技術(shù)新進(jìn)展[A];2017年浙江省微生物學(xué)會(huì)青年論壇——微生物與健康專(zhuān)題研討會(huì)會(huì)議資料[C];2017年

2 李慧艷;陳倩;張正;;北京2008年奧運(yùn)會(huì)相關(guān)餐飲業(yè)食源性致病菌監(jiān)測(cè)分析[A];北京市營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第四屆會(huì)員代表大會(huì)暨膳食與健康研討會(huì)論文集[C];2010年

3 李小春;陳慧燕;章樂(lè)怡;李毅;王良懷;洪程基;吳躍進(jìn);;溫州地區(qū)食源性致病菌污染調(diào)查[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

4 李薇;檀玲;劉海泉;潘迎捷;趙勇;;食源性致病菌生物被膜形成研究[A];中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第十五屆年會(huì)論文摘要集[C];2018年

5 伊廷存;孟靜;鄭世超;翟清燕;霍勝楠;;免疫膠體金技術(shù)在食源性致病菌中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用[A];第八屆食品質(zhì)量安全技術(shù)論壇論文集[C];2017年

6 張妍;王春梅;劉英玉;阿里木江·斯拉木;姚剛;鄭曉琴;蘇戰(zhàn)強(qiáng);張曉紅;;庫(kù)爾勒市動(dòng)物性食品中食源性致病菌的分離鑒定和致病性研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

7 王劍平;李杜娟;;生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌上的應(yīng)用[A];2007年中國(guó)農(nóng)業(yè)工程學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2007年

8 王素英;申江;;微生物污染及食源性致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)[A];第3屆中國(guó)食品冷藏鏈新設(shè)備、新技術(shù)論壇論文集[C];2007年

9 張艷芳;謝芝勛;劉加波;曾婷婷;謝麗基;鄧顯文;謝志勤;羅思思;黃莉;黃嬌玲;王盛;;7種食源性致病菌GeXP多重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十七次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2017年

10 田娟;譚英智;陳文君;鐘青萍;;多重PCR快速檢測(cè)三種食源性致病菌的研究[A];第五屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)論文摘要集[C];2013年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 郝娜;斑點(diǎn)蛋是否真的有害？[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2017年

2 實(shí)習(xí)生 李玉潔;我市完成上半年食源性致病菌監(jiān)測(cè)[N];張掖日?qǐng)?bào);2011年

3 魏小剛;我國(guó)食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)取得新突破[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

4 記者 梁曉　通訊員 高世博 盧yN舟;我市完成食源性致病菌監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)[N];鄭州日?qǐng)?bào);2011年

5 公共衛(wèi)生科;我市圓滿完成2010年食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作[N];馬鞍山日?qǐng)?bào);2011年

6 記者 李嵐 通訊員 朱巍 梁秀梅;我市實(shí)現(xiàn)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)全覆蓋[N];洛陽(yáng)日?qǐng)?bào);2013年

7 陳曦　王長(zhǎng)文;“我是一名普通的檢驗(yàn)員”[N];中國(guó)國(guó)門(mén)時(shí)報(bào);2010年

8 記者 顏志華;新疆食品安全整體狀況明顯向好[N];中國(guó)食品安全報(bào);2012年

9 記者 晁瑾　實(shí)習(xí)生 趙春娟;我區(qū)食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)初步建立[N];新疆日?qǐng)?bào)(漢);2011年

10 本報(bào)記者 路平;廣東應(yīng)急產(chǎn)業(yè)形成“榕樹(shù)”集聚效應(yīng)[N];廣東科技報(bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孫嘉笛;基于納米金增強(qiáng)效應(yīng)新型生物傳感方法構(gòu)建及其在食源性致病菌毒力基因及miRNAs檢測(cè)的應(yīng)用[D];江南大學(xué);2019年

2 孫向華;北京生豬屠宰場(chǎng)豬肉產(chǎn)品食源性致病菌污染狀況調(diào)查與研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

3 張曉峰;基于肽核酸熒光原位雜交技術(shù)的食源性致病菌鑒定系統(tǒng)研究及其應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2017年

4 邱馳;影響食品安全的食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)與風(fēng)險(xiǎn)分析研究[D];沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 盧行安;宮頸癌患者核糖核酸酶抑制因子基因突變分析和常見(jiàn)食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)體系的建立[D];大連醫(yī)科大學(xué);2007年

6 郭丹;兩種重要食源性致病菌O血清型分子分型系統(tǒng)的建立、兩株不同宿主來(lái)源的大腸桿菌比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];南開(kāi)大學(xué);2013年

7 汪陳潔;乳酸對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌的抗菌活性與作用機(jī)理[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 王靈;快速特異檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的B細(xì)胞生物傳感器研究[D];浙江大學(xué);2015年

9 徐李舟;基于量子點(diǎn)的熒光生物與化學(xué)傳感器及其食品安全快速檢測(cè)應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2016年

10 王力均;基于免疫磁分離和核酸適配子技術(shù)快速檢測(cè)食源性致病菌的研究[D];南昌大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉寬;食源性致病菌多重?zé)晒舛�量PCR檢測(cè)體系的建立[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2018年

2 謝同彬;量子點(diǎn)—納米金復(fù)合探針檢測(cè)食源性致病菌的方法研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 陳飛;鄭州市售生鮮豬肉及待宰生豬主要食源性致病菌污染檢測(cè)與分析[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

4 龔少瑩;橄欖多酚對(duì)食源性致病菌的抑菌作用及機(jī)理研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

5 鄢雷娜;乳制品中三種食源性致病菌活菌快速檢測(cè)方法的研究及檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用[D];南昌大學(xué);2018年

6 馬麗娜;基于代謝產(chǎn)物的食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)研究[D];中南林業(yè)科技大學(xué);2014年

7 錢(qián)靜;安徽省食品中食源性致病菌監(jiān)測(cè)結(jié)果研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

8 葉明強(qiáng);免疫熒光法及紅外光譜法在食源性致病菌檢測(cè)中的研究[D];上海師范大學(xué);2009年

9 劉寧偉;三種食源性致病菌多重環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年

10 周明東;食源性致病菌快速檢測(cè)方法的建立及其試劑盒的研制與應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2600293