核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是油菜等許多作物上的重要病害,目前對這一病害缺乏經濟、有效及穩(wěn)定的防治措施,急需探討新的防治策略。利用由真菌病毒引起核盤菌致病力衰退,對生物防治菌核病具有潛在的應用價值。本研究以陜西省漢中市發(fā)病油菜莖稈內菌核分離的SX466為材料,它的菌絲為短絨毛狀、菌落邊緣致密、表面上形成大量白色氣生菌絲、菌絲尖端彎曲、菌絲生長速度緩慢、不產生菌核、致病力弱、表現出明顯的低毒現象。經克隆分析發(fā)現它攜帶了三種真菌病毒:Sclerotinia sclerotiorum megabirna virus 1(Ss MBV1),基于Rd Rp的進化分析,清楚的表明它和Rosellinia necatrix megabirnavirus 1(Rn MBV1)親緣關系最近,相似率44%;Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2/SX466(Ss MV2/SX466)和Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2的另兩個種同源性高度92%;Sclerotinia sclerotiorum...

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【學位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1 核盤菌和菌核病的研究進展
        1.1 核盤菌的危害及致病機理
            1.1.1 核盤菌的危害
            1.1.2 核盤菌的致病機理
        1.2 菌核病的防治
            1.2.1 抗病品種選育
            1.2.2 農業(yè)防治
            1.2.3 化學防治
            1.2.4 生物防治
    2 真菌病毒的研究進展
        2.1 真菌病毒的分類
        2.2 真菌病毒與病原真菌的互作
            2.2.1 重要的病原真菌-真菌病毒互作系統(tǒng)
                2.2.1.1 Cryphonectria parasitica - CHV1/EP713互作系統(tǒng)
                2.2.1.2 Helminthosporium victoriae-Hv V190S互作系統(tǒng)
                2.2.1.3 Rosellinia necatrix-My RV3互作系統(tǒng)
                2.2.1.4 Sclerotinia sclerotiorum-Ss DRV和Sclerotinia sclerotiorum-Ss HDV-1 互作系統(tǒng)
                2.2.1.5 Botrytis cinerea-BVF互作系統(tǒng)
                2.2.1.6 Fusarium graminearum -Fg V1互作系統(tǒng)
            2.2.2 基因沉默的病毒抑制子
        2.3 衛(wèi)星RNA病毒
        2.4 真菌病毒的傳播
        2.5 真菌病毒與病毒進化
        2.6 高通量轉錄組測序在中生物學領域的應用
        2.7 真菌病毒與生物防治
    3 本研究目的與意義
第二章 核盤菌低毒菌株SX466的生物學特性及SSMBV1的相關研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 供試菌株
            1.1.2 供試植物
            1.1.3 主要試劑、酶及試劑盒
            1.1.4 培養(yǎng)基
            1.1.5 主要載體及引物
            1.1.6 主要儀器和設備
        1.2 試驗方法
            1.2.1 菌株的分離、活化與培養(yǎng)
            1.2.2 菌落形態(tài)觀察
            1.2.3 生長速度測定
            1.2.4 致病力測定
            1.2.5 菌絲中ds RNA的提取及純化
            1.2.6 總RNA提取
            1.2.7 RT-PCR
            1.2.8 全長序列的克隆及序列拼接
                1.2.8.1 Ss MBV1的隨機引物克隆
                1.2.8.2 Ss MBV1的特異性克隆
                1.2.8.3 Ss MBV1的末端序列克隆
                1.2.8.4 序列拼接與分析
            1.2.9 Ss MBV1水平傳播能力的測定
            1.2.10原生質體制備
            1.2.11病毒粒體的提純
                1.2.11.1 用蔗糖密度梯度法提取病毒粒體
                1.2.11.2 用氯化銫密度梯度法提取病毒粒體
            1.2.12病毒粒體的負染透射電鏡觀察（TEM）
            1.2.13病毒粒子的核酸的裂解檢測
            1.2.14病毒粒體結構蛋白的檢測
            1.2.15病毒粒子結構蛋白的指紋圖譜分析（PMF）
            1.2.16 PEG介導病毒粒子轉染核盤菌原生質體
            1.2.17 Northern雜交
                1.2.17.1 電泳、轉膜及固定
                1.2.17.2 預雜交
                1.2.17.3 地高辛標記DNA探針
                1.2.17.4 雜交
                1.2.17.5 洗膜及顯色
    2 結果與分析
        2.1 核盤菌低毒菌株SX466的生物學性狀
            2.1.1 核盤菌低毒菌株SX466菌落形態(tài)異常和生長速度緩慢
            2.1.2 菌株SX466具有弱致病性
        2.2 SX466中的真菌病毒研究
            2.2.1 SX466攜帶真菌病毒且形成病毒粒體
            2.2.2 真菌病毒Ss MBV1的克隆和基因組結構分析
            2.2.3 Ss MBV1系統(tǒng)發(fā)育樹
            2.2.4 L2-ds RNA/Ss MBV1中蛋白酶 3D結構預測
            2.2.5 L2-ds RNA的蛋白酶結構域系統(tǒng)進化分析
        2.3 菌株SX466中真菌病毒水平傳播能力研究
            2.3.1 菌株SX466中真菌病毒可水平傳播
            2.3.2 水平傳播衍生菌株電鏡觀察和核酸裂解
        2.4 SSMBV1病毒粒體轉染核盤菌原生質體研究
            2.4.1 病毒粒體直接侵染核盤菌原生質體
            2.4.2 轉染子中含有球形病毒粒體及ds RNA
            2.4.3 病毒粒體的結構蛋白主要由ORF1編碼
        2.5 SSMBV1序列具有特異性
    3 結論與討論
        3.1 攜帶DSRNA的SX466表現低毒特性
        3.2 SSMBV1基因組解析及其分類地位界定
        3.3 L2-DSRNA可能是L1-DSRNA的衛(wèi)星RNA
        3.4 水平基因轉移
        3.5 真菌病毒在不同菌株間水平傳播
第三章 核盤菌低毒菌株SX466中L2-DSRNA/SSMBV1的功能分析
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 供試菌株
            1.1.2 供試植物
            1.1.3 主要試劑、酶及試劑盒
            1.1.4 培養(yǎng)基
            1.1.5 主要載體及引物
            1.1.6 主要儀器和設備
        1.2 試驗方法
            1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng)
            1.2.2 菌株的生物學性狀測定
            1.2.3 RT-PCR和Real-Time PCR
            1.2.4 質粒的提取
            1.2.5 病毒基因沉默
                1.2.5.1 沉默載體構建
                1.2.5.2 農桿菌電擊轉化
                1.2.5.3 ATMT介導的真菌轉化
                1.2.5.4 轉化子的驗證
            1.2.6 高通量轉錄組測序（RNA-Seq ）
    2 結果與分析
        2.1 DSRNA可以進行水平傳播
        2.2 PEG介導病毒粒子轉染核盤菌原生質體
            2.2.1 轉染子生物學特性
            2.2.2 L2-ds RNA對L1-ds RNA累積量的影響
        2.3 病毒基因沉默對寄主核盤菌的影響
        2.4 轉錄組測序分析
            2.4.1 轉錄組數據q PCR驗證
            2.4.2 差異基因的GO功能顯著性富集分析
            2.4.3 差異基因的KEGG顯著性富集分析
    3 結論與討論
        3.1 L2-DSRNA的作用
        3.2 被真菌病毒感染前后的核盤菌中存在多個差異表達基因
        3.3 基因沉默對核盤菌的影響
第四章 低毒菌株SX466中其它真菌病毒研究
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 供試菌株
            1.1.2 主要試劑、酶及試劑盒
            1.1.3 培養(yǎng)基
            1.1.4 主要載體及引物
            1.1.5 主要儀器和設備
        1.2 試驗方法
            1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng)
            1.2.2 真菌病毒克隆
    2 結果與分析
        2.1 SX466中其它真菌病毒研究
            2.1.1 M-ds RNA和S-ds RNA基因組的克隆
            2.1.2 Ss MV2/SX466和Ss PV/SX466系統(tǒng)發(fā)育樹構建
        2.2 菌株SX466中M-DSRNA和S-DSRNA水平傳播能力測定
    3 結論與討論
第五章 結論與展望
    1 結論
        1.1 SX466的生物學特性和SSMBV1的基因組分析
            1.1.1 SX466的生物學特性
            1.1.2 Ss MBV1的基因組分析
        1.2 SSMBV1水平傳播和體外傳播
            1.2.1 Ss MBV1水平傳播
            1.2.2 Ss MBV1體外傳播
        1.3 L2-DSRNA/SSMBV1的功能研究
        1.4 SX466中M-DSRNA和S-DSRNA研究
    2 展望
參考文獻
附錄 1：結構蛋白指紋圖譜分析
附錄 2: SX466菌種中M-DSRNA和S-DSRNA部分基因組序列
致謝



本文編號：4001579