發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 10:08

　　 進(jìn)一步完善滇重樓人工栽培技術(shù)是其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必由之路。除了優(yōu)化種質(zhì)資源、科學(xué)的田間管理之外,深入挖掘內(nèi)生微生物資源也勢(shì)必對(duì)滇重樓的可持續(xù)利用大有裨益。本論文針對(duì)滇重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌的多樣性這一基本科學(xué)問題,通過選擇性分離培養(yǎng)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)兩種方法策略,對(duì)滇重樓內(nèi)生細(xì)菌資源進(jìn)行全面的分析和挖掘。同時(shí)多樣性研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌是優(yōu)勢(shì)類群之一,且通過分離培養(yǎng)得到一批相關(guān)菌株,因此論文圍繞根瘤菌開展了深入的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)的研究。首先通過高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)云南省4個(gè)地區(qū)的滇重樓根莖內(nèi)生及根際土壤環(huán)境細(xì)菌進(jìn)行了生物多樣性及群落功能的比較分析。兩者中均蘊(yùn)藏豐富的細(xì)菌類群,主要分布于放線菌門、厚壁菌門和變形桿菌門,但根際土壤的細(xì)菌類群多樣性更高。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)兩者存在差異,在目級(jí)分類水平上,優(yōu)勢(shì)類群有異同、且有的類群在相對(duì)豐度上差異顯著。通過對(duì)群落功能的預(yù)測(cè)和比較發(fā)現(xiàn),根際土壤與根莖內(nèi)生環(huán)境的群落功能也存在顯著差異。此外,在對(duì)不同樣點(diǎn)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),中甸樣點(diǎn)根莖內(nèi)生樣本的細(xì)菌多樣性較其他樣點(diǎn)不同,但群落功能無明顯差異,表明中甸樣點(diǎn)根莖內(nèi)生樣本中的主要優(yōu)勢(shì)功能類群與其它樣本一致。在隨后的純培養(yǎng)研究中,通過7種分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng),共獲得并鑒定云南6個(gè)地區(qū)滇重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌289株。相比免培養(yǎng)研究中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群分布于3個(gè)門,18個(gè)目,83個(gè)屬,純培養(yǎng)分離到的菌株分布于同樣的3個(gè)門,并分屬于5個(gè)綱、14個(gè)目、25個(gè)科、42個(gè)屬,其中包括22個(gè)潛在的新分類單元；在每個(gè)樣點(diǎn)中都分離到不同于其它樣點(diǎn)的屬一級(jí)類群。此外,35株菌的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到甾體皂苷類化合物；25株菌可在無氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。對(duì)4個(gè)潛在新分類單元的菌株進(jìn)行多相分類研究,確定了它們的分類地位。菌株py1111~T、Py1134~T為Rhizobium屬的新種,分別命名為Rhizobium radicis sp. nov及Rhizobium gengmaense sp. nov.; py1294~T為Oceanobacillus屬的1個(gè)新種,命名為Oceanobacillus endoradicis sp. nov.; py 1292~T為Yimella屬的1個(gè)新種,命名為Yimellaradicis sp. nov.。通過測(cè)定41株Rhizobium屬典型種基因組序列和系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)Rhizobium屬及其近緣類群形成4個(gè)主要的進(jìn)化分枝,多數(shù)具有共生固氮功能的典型Rhizobium屬物種處于較晚的進(jìn)化分枝上。對(duì)共生固氮相關(guān)蛋白的深入比較分析發(fā)現(xiàn),共生質(zhì)粒同源蛋白在Rhizobium屬及其近緣類群中起源較早,基因缺失是造成一些物種丟失固氮作用的主要原因。共生固氮作用中的關(guān)鍵蛋白NifH、FixC和NodC在該類群中的平均相似性差異表明,它們?cè)谶M(jìn)化過程中受到不同的選擇壓力,或者個(gè)別基因存在橫向基因轉(zhuǎn)移的可能。從基因組層面深入分析了相關(guān)類群各物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,闡明了共生固氮在Rhizobium屬及其近緣類群中演化的主要機(jī)制。本論文的研究結(jié)果有助于理解根際土壤微生物菌群與滇重樓內(nèi)生菌群之間的關(guān)系、全面認(rèn)知滇重樓根莖內(nèi)生細(xì)菌的物種多樣性,并為積累與滇重樓有關(guān)的內(nèi)生菌資源打下基礎(chǔ),更為人工栽培技術(shù)的優(yōu)化提供理論指導(dǎo)。同時(shí)通過分離純培養(yǎng)獲得一批與滇重樓相關(guān)的內(nèi)生細(xì)菌資源,為后期菌種資源開發(fā)提供寶貴的材料。圍繞根瘤菌屬及其近緣類群的系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)理論研究,首次嘗試從組學(xué)層面解決相關(guān)類群的系統(tǒng)分類學(xué)問題,并在該類群中共生固氮作用起源進(jìn)化研究方面取得重要進(jìn)展。與植物宿主相關(guān)微生物群落、菌種資源是微生物功能開發(fā)、群落生態(tài)、系統(tǒng)進(jìn)化等研究的重要材料,相信隨著高通量測(cè)序和純培養(yǎng)技術(shù)的突破,植物內(nèi)生微生物學(xué)研究將取得不斷發(fā)展,并推動(dòng)微生物資源的開發(fā)與利用。
【學(xué)位單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S567.239;S182
【部分圖文】：

云南大學(xué)博±學(xué)位論文??２．２．２實(shí)時(shí)巧光定量ＰＣＲ結(jié)果??通過實(shí)時(shí)巧光定量ＰＣＲ對(duì)來源于耿馬、楚雄、中甸、彌勒及個(gè)舊這５個(gè)樣點(diǎn)??的根莖內(nèi)生及根際主壤樣品中的細(xì)菌１６ＳｒＲＮＡ基因及真菌ＩＴＳ基因進(jìn)行了絕對(duì)定??量，定量結(jié)果如表２．１所示。５個(gè)不同樣點(diǎn)的濱重樓根際主壤樣品中，細(xì)菌與真菌??的數(shù)量大致相當(dāng)，耿馬、中甸、個(gè)舊的樣品中真菌略占多數(shù)（分別為６４．２％，５９．７％，??６７．１％），楚雄和彌勒的樣品中細(xì)菌略占多數(shù)（５６．５％，５４．１％）。與此不同的是，濱??重樓根莖內(nèi)生菌在不同的樣點(diǎn)中均細(xì)菌為主，占比達(dá)到９９．９％，只有Ｐ００２為??９５．６％；而真菌僅占極少量煙２．３）。該結(jié)果表明在演重樓根莖內(nèi)生環(huán)境中，細(xì)菌??比真菌多；而根際止壤中兩者數(shù)量基本相當(dāng)。這也從一方面表明對(duì)演重樓根莖內(nèi)??生樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性研究的重要。??＾＂

第二章潰重樓根莖內(nèi)生及根際王巧環(huán)境細(xì)免培養(yǎng)多樣性研巧??維度上距離稍遠(yuǎn)，物種組成有不同。只有來自楚雄的其中一個(gè)樣品作００７）與其他??植物內(nèi)生樣品偏離較明顯，在圖中位置居于根際±壌和其他植物內(nèi)生樣品之間，??考慮是否在樣品處理過程中，表面消毒不徹底所致。同時(shí)，４個(gè)樣點(diǎn)的根際±壤樣??品聚在ＰＣｏＡ圖右側(cè)，尤其是中甸、彌勒、耿馬的樣品在圖上坐標(biāo)軸的距離較近，??表明它們的物種組成類似，而楚雄樣品的位置稍遠(yuǎn)，這個(gè)結(jié)果與上節(jié)中通過Ａｌｐｈａ??多樣性分析所揭示的結(jié)果一致。??

在Ｗ?ｗｅｉｇｈｔｅｄ構(gòu)建的聚類樹上與同來源于楚雄根際的樣品Ｐ０２５聚在一枝，與ＰＣｏＡ??圖得到的結(jié)果類似；而在ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ計(jì)算方法構(gòu)建的聚類樹上Ｐ００７與根莖內(nèi)生樣??品聚在一起。４個(gè)樣點(diǎn)的植物內(nèi)生樣品在聚類圖上交雜在一起，并沒有表現(xiàn)出明雖??的樣點(diǎn)間的差異。??２．２．３．５織巧群落功能巧諷??樣品中ＯＴ化序列信息在ＫＥＧＧ數(shù)據(jù)庫(kù)中影射的結(jié)果（圖２．１０）顯示，耿馬漠??重樓根莖內(nèi)生樣品ＯＴＵｓ能夠映射到的基因組功能信息比例最高，超過９０％；其??次分別為楚雄、中甸的內(nèi)生樣品，而彌勒２個(gè)樣品的差異較大。前面的分析中，??己注意到楚雄的Ｐ００７樣品與其他內(nèi)生樣品的群落多樣性不同，而其在ＫＥＧＧ的未??匹配比例也較楚雄樣點(diǎn)的其他２個(gè)樣品離。根際±壤環(huán)境樣品的未匹配比例均較??內(nèi)生環(huán)境高，尤其是彌勒、中甸、耿馬的樣品有超過４０％的ＯＴＵｓ片段未在ＫＥＧＧ??數(shù)據(jù)庫(kù)中影射到相關(guān)結(jié)果，說明±壌樣品中存在大量未知的類群。??夏
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2894535