發(fā)布時(shí)間：2020-11-22 08:25

　　 橘小實(shí)蠅(Bactrocera dorsalis)是一種危害250多種果實(shí)和蔬菜的重要農(nóng)業(yè)害蟲,給我國(guó)果蔬生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。昆蟲具有多種多樣的性別決定機(jī)制,不僅不同昆蟲通過(guò)不同的基因和調(diào)控機(jī)制決定性別分化,甚至在同種昆蟲不同品系之間性別決定機(jī)制也不盡相同。昆蟲中決定性別的初始染色體信號(hào)差異較大,其中最典型的是Y染色體連接的雄性決定因子(M factor)決定雄性性別發(fā)育。但是,在包括橘小實(shí)蠅在內(nèi)的多種昆蟲中,假定的M因子還是未知的。本研究以橘小實(shí)蠅為研究對(duì)象,利用RNA干擾(RNAi)、CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)和高通量測(cè)序技術(shù)等分子生物學(xué)手段,研究了橘小實(shí)蠅性別決定關(guān)鍵基因transformer的功能;鑒定出一種小分子micro RNA作為雄性決定因子調(diào)控橘小實(shí)蠅早期胚胎性別分化;鑒定和研究了多種橘小實(shí)蠅性別偏向性microRNAs在兩性發(fā)育中的作用;驗(yàn)證了保守性Let-7調(diào)控橘小實(shí)蠅發(fā)育過(guò)程。對(duì)橘小實(shí)蠅性別決定分子機(jī)制的研究,不僅為探索昆蟲性別分化通路上類似基因的功能,以及確定新的性別決定基因提供參考,而且為昆蟲的遺傳操作提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。本研究為發(fā)展不依賴輻射處理的不育害蟲防治技術(shù)(SIT)提供了新的策略。1.Transformer基因是昆蟲性別決定級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的一個(gè)雙開(kāi)關(guān)基因,通過(guò)選擇性剪切來(lái)實(shí)現(xiàn)性別分化。為闡明性別決定關(guān)鍵基因在調(diào)控雌雄分化和雌蟲繁殖力中的功能,我們分離鑒定了橘小實(shí)蠅transformer和transformer-2,Bdtra經(jīng)過(guò)選擇性剪切轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩種雄特異和一種雌特異的亞型,雌特異的亞型能翻譯成有功能的TRA蛋白,而雄特異的亞型由于終止密碼子不能翻譯成有功能的TRA蛋白。Bdtra上存在的TRA/TRA-2結(jié)合位點(diǎn)表明,TRA和TRA-2作為剪切調(diào)控因子通過(guò)Bdtra反饋調(diào)節(jié)來(lái)維持和促進(jìn)雌性的性別發(fā)育。早期胚胎發(fā)育過(guò)程中雌特異tra的表達(dá)模中tra-f在15小時(shí)達(dá)到高表達(dá)。通過(guò)RNA干擾對(duì)Bdtra進(jìn)行了功能研究,發(fā)現(xiàn)胚胎期敲除Bdtra基因能導(dǎo)致雌蟲雄性化,表明橘小實(shí)蠅在胚胎早期實(shí)現(xiàn)性別分化;成蟲期敲除Bdtra基因能降低雌蟲卵黃蛋白基因yolk protein gene(Bdyp1)的表達(dá),進(jìn)而降低雌蟲產(chǎn)卵量,表明Bdtra基因能正向調(diào)控卵黃蛋白基因Bdyp1的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明利用性別決定關(guān)鍵基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因性別品系,通過(guò)釋放競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)的不育雄蟲后代,能夠提高昆蟲不育技術(shù)對(duì)橘小實(shí)蠅的防治。2.MicroRNAs(miRNAs)是一類小的內(nèi)源非編碼RNAs,能夠調(diào)控包括兩性異形在內(nèi)的多種生理過(guò)程。然而,至今沒(méi)有對(duì)橘小實(shí)蠅雌雄成蟲和生殖腺中miRNAs進(jìn)行鑒定以及對(duì)miRNAs在性腺分化中的作用進(jìn)行闡述。我們通過(guò)對(duì)橘小實(shí)蠅性成熟雌蟲、雄蟲、卵巢和精巢構(gòu)建small RNA文庫(kù),測(cè)序數(shù)據(jù)分析鑒定出183個(gè)已知和120個(gè)新miRNAs。對(duì)4個(gè)文庫(kù)中miRNAs表達(dá)量進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)18個(gè)雌性偏向表達(dá)和16個(gè)雄性偏向表達(dá)miRNAs,這些性別偏向性miRNAs可能參與性別分化。通過(guò)靶標(biāo)基因軟件預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)雌偏向性miR-989-3p靶向?qū)嵪壙评ハx性別決定關(guān)鍵基因doublesex(dsx),這表明miR-989-3p可能參與調(diào)控橘小實(shí)蠅性別分化。對(duì)雌成蟲飼喂miR-989-3p、miR-994-5p、miR-309-3p和miR-6-3p抑制劑促進(jìn)產(chǎn)卵量的增加,對(duì)雄成蟲飼喂miR-8-3p、miR-34-5p、miR-1-3p和miR-12-5p抑制劑使得雄蟲交配競(jìng)爭(zhēng)力下降,對(duì)雌雄成蟲飼喂以上抑制劑都降低了成蟲存活壽命。這些結(jié)果表明性別偏向性miRNAs在維持雌雄生殖力和壽命中起著重要作用。本研究首次揭示了橘小實(shí)蠅性別分化相關(guān)的miRNAs的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)miRNAs在性別間差異表達(dá),這將促進(jìn)生殖器官特異表達(dá)miRNAs的功能研究。3.在一些實(shí)蠅科昆蟲中,Y染色體連接的雄性決定因子(M factor)啟動(dòng)性別決定途徑中的基本信號(hào)。然而,橘小實(shí)蠅中M因子及其性別決定分子機(jī)制還尚不明確。在本研究中,我們鑒定到橘小實(shí)蠅早期胚胎雄性性別發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期是產(chǎn)卵后5、6和7小時(shí),對(duì)5、6和7小時(shí)胚胎構(gòu)建small RNA文庫(kù),鑒定出65個(gè)胚胎差異表達(dá)miRNAs。在這些miRNAs中,有8個(gè)和Bdtra基因3?非編碼端(3?UTR)序列有堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合位點(diǎn),其中結(jié)合自由能最低的是miR-1-3p。在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明miR-1-3p能抑制Bdtra的表達(dá)。胚胎注射miR-1-3p類似物和抑制劑分別下調(diào)62%和上調(diào)109%的Bdtra表達(dá)量,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明Bdtra是miR-1-3p的靶標(biāo)基因。另外,胚胎注射miR-1-3p類似物導(dǎo)致后代雄性化(92%的雄性后代表型),注射miR-1-3p抑制劑能導(dǎo)致后代雌性化(77%的雌性后代表型)。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-1-3p導(dǎo)致突變雄性個(gè)體完全逆轉(zhuǎn)為雌性表型,且Bdtra和Bddsx基因進(jìn)行雌性特異剪切表達(dá),這些結(jié)果表明miR-1-3p對(duì)橘小實(shí)蠅早期胚胎雄性性別決定是必需的,miR-1-3p作為雄性決定因子中間體,可能受到Y(jié)染色體連接的基本信號(hào)的激活,參與性別調(diào)控。4.MicroRNAs(miRNAs)調(diào)控昆蟲發(fā)育中多種生理過(guò)程,但是miRNAs在橘小實(shí)蠅幼蟲至蛹期發(fā)育中的作用還是未知的。在本研究中,利用在HEK293T細(xì)胞中的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Bdo-Let-7作用于Bd E75基因的3?非編碼端(3?UTR),抑制Bd E75基因的表達(dá)。Bdo-Let-7和Bd E75在幼蟲至蛹期發(fā)育過(guò)程和不同組織中是共表達(dá)的。對(duì)三齡幼蟲注射Bdo-Let-7類似物和抑制劑分別下調(diào)62%和上調(diào)94%的Bd E75表達(dá)量。對(duì)第五天幼蟲注射20-羥基蛻皮酮(20E)3、12、24和48小時(shí)后,Bdo-Let-7表達(dá)量分別上調(diào)82%、91%、110%和144%。另外,注射Bdo-Let-7抑制劑后觀察到幼蟲異常的化蛹和羽化現(xiàn)象。依據(jù)以上結(jié)果,我們證實(shí)Bdo-Let-7調(diào)控蛻皮激素信號(hào)途徑基因Bd E75的正常劑量表達(dá),從而維持橘小實(shí)蠅幼蟲至蛹期的正常發(fā)育。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433
【部分圖文】：

Nix 基因是 transformer-2 (tra-2)基因的同源基因（圖1.3）。圖 1.3 蚊子中性別決定途徑Figure 1.3 The sex determination pathway in mosquito (Sinkins 2016)1.2 昆蟲性別決定 transformer 基因1.2.1 Transformer 基因概括Transformer 基因在包括雙翅目昆蟲如實(shí)蠅科、家蠅科、膜翅目、鞘翅目昆蟲中高度保守，在性別決定機(jī)制中作為關(guān)鍵因子調(diào)控性別分化(Verhulst et al 2010b;Gempe and Beye 2011)。地中海實(shí)蠅 C. capitata (Pane et al 2002)、橄欖果實(shí)蠅Bactrocera oleae (Lagos et al 2007)、銅綠蠅 Lucilia cuprina (Concha and Scott 2009)、加勒比按實(shí)蠅Anastrepha suspensa (Schetelig et al2012)、昆士蘭實(shí)蠅Bactrocera tryoni和扎氏果實(shí)蠅 Bactrocera jarvisi (Morrow et al 2014) tra 基因都含有雄性特異的外顯子，上面有使轉(zhuǎn)錄停止的終止密碼子，在雄蟲中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生無(wú)功能的 TRA蛋白。在雌蟲中，雄性特異的外顯子被剪切掉而產(chǎn)生有功能的 TRA 蛋白。這些實(shí)蠅科物種 tra基因組結(jié)構(gòu)和性別特異性剪切是相似的，雄性特異外顯子上都有 TRA/TRA-2 結(jié)合位點(diǎn)，表明在這些物種中都存在一個(gè)自動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)維持 tra 的雌性特異表達(dá)（圖

圖 1.4 實(shí)蠅科物種 transformer 基因結(jié)構(gòu)比較 1.4 Comparison of the organization of transformer genes from tephritid speciesand Scott 2009)家蠅中，Mdtra 基因有活力時(shí)指導(dǎo)雌性分化，而無(wú)活力時(shí)指導(dǎo)雄er et al 2010; Sharma et al 2017)。在翅擬谷盜 Tribolium castaneum 和a vitripennis 中，tra 基因通過(guò)調(diào)控 dsx 基因性別特異剪切方式控制雌性hulstet al 2010a;Shukla and Palli 2012a)。在地中海實(shí)蠅中，胚胎干擾雌性個(gè)體轉(zhuǎn)化為可育雄性個(gè)體(Pane et al 2002)。在其它雙翅目、膜翅蟲中，胚胎期 tra 干擾實(shí)驗(yàn)也導(dǎo)致雌性個(gè)體不同程度雄性化，且雄性影響(Beye et al 2003; Lagos et al 2007; Hediger et al 2010; Schetelig et and Palli 2012a)。盡管昆蟲中 tra 基因的核苷酸序列和氨基酸組分差們作為dsx 基因性別特異性剪切調(diào)控因子的功能是保守的。在雄蟲中特異的選擇性剪切產(chǎn)生含有終止密碼子的轉(zhuǎn)錄本，從而產(chǎn)生無(wú)功能的

圖 1.7 三類主要的調(diào)控小 RNAsFigure 1.7 Three main classes of regulatory small RNAs (Lucas et al 2013)1 MicroRNAs 生物合成和調(diào)控機(jī)制microRNAs (miRNAs)是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控者，在進(jìn)化上高度保守，在長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。編碼 miRNA 的基因首先在細(xì)胞核 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄成初始 miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)，接著被 RNrosha 剪切為長(zhǎng)度約 70-90 nt 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體 miRNA (precursor mmiRNA)，隨即在核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Exportin-5)的攜帶下從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到被 RNase III 內(nèi)切酶 Dicer-1 將其末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)切除，產(chǎn)生長(zhǎng) 22 nt 剪切NA:miRNA 雙鏈復(fù)合體，miRNA 二倍體結(jié)合到 Argonaute (Ago)蛋白上，進(jìn)進(jìn)入 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，其中一單鏈 miRNA 被保留下來(lái)，通過(guò)與靶標(biāo)基因 mRNA 的 3 非編碼端(untra
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