發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 11:28

【摘要】：近年來,近海水域的富營(yíng)養(yǎng)化程度越來越嚴(yán)重,導(dǎo)致全球性赤潮的爆發(fā)次數(shù)日益增多。赤潮的爆發(fā)不僅威脅人類健康,造成漁業(yè)巨大損失,還引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境和生態(tài)問題。因此,建立高效、靈敏的赤潮微藻的檢測(cè)方法很有必要。本論文以我國(guó)東海常見的3種赤潮藻,即強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)、鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)和米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)為目標(biāo),將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)與橫向流動(dòng)試紙條(lateral flow dipstick,LFD)結(jié)合,分別建立其LAMP LFD檢測(cè)技術(shù)。論文以目標(biāo)藻轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)(internal transcribed spacers,ITS)或核糖體大亞基(large subunit,LSU)為檢測(cè)靶標(biāo),首先通過基因組DNA提取和克隆測(cè)序獲得靶序列,根據(jù)靶序列進(jìn)行LAMP引物和檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)、合成與篩選;其次,建立目標(biāo)藻的LAMP LFD檢測(cè)體系,對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化;最后對(duì)LAMP LFD技術(shù)的特異性、靈敏度及實(shí)用性進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)估。對(duì)強(qiáng)壯前溝藻的ITS序列進(jìn)行克隆,并用其設(shè)計(jì)1套LAMP引物及1條檢測(cè)探針;對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化后用我國(guó)東海沿岸常見微藻作為受試對(duì)象,對(duì)LAMP LFD進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試,表明LAMP LFD對(duì)強(qiáng)壯前溝藻具有特異性;分別以強(qiáng)壯前溝藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行靈敏度測(cè)試,顯示LAMP LFD的檢測(cè)限分別為8.34×10~-44 ng·μL~(-1)和1.86×10~4 copies·μL~(-1),靈敏度均比常規(guī)PCR高100倍;模擬自然水樣測(cè)試得LAMP LFD對(duì)目標(biāo)藻的檢測(cè)限為約10 cells·mL~(-1),靈敏度比常規(guī)PCR高10倍。對(duì)鏈狀亞歷山大藻ITS序列進(jìn)行克隆,以其為靶序列成功設(shè)計(jì)3套LAMP引物(AcLF1、AcLF2和AcLF3),篩選確定最優(yōu)引物AcLF2,并設(shè)計(jì)1條檢測(cè)探針;用最優(yōu)引物建立檢測(cè)體系并進(jìn)行優(yōu)化;交叉反應(yīng)測(cè)試顯示LAMP LFD對(duì)鏈狀亞歷山大藻具有特異性;LAMP LFD對(duì)鏈狀亞歷山大藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒的檢測(cè)限為4.63×10~(-4)ng·μL~(-1)和1.26×10~4copies·μL~(-1),均顯示其靈敏度比常規(guī)PCR高100倍;模擬水樣測(cè)試顯示,LAMP LFD對(duì)目標(biāo)藻的檢測(cè)限約為10~-11 cells·mL~(-1),靈敏度較常規(guī)PCR高100倍�？寺∶资蟿P倫藻ITS序列,并用其設(shè)計(jì)2套LAMP引物(KmLF1和KmLF2),用實(shí)驗(yàn)室前期獲得的LSU序列再設(shè)計(jì)2套引物(KmLF3和KmLF4),對(duì)4套引物進(jìn)行篩選確定最優(yōu)引物KmLF3,并根據(jù)LSU序列設(shè)計(jì)1條檢測(cè)探針;優(yōu)化建立的LAMP體系;交叉反應(yīng)測(cè)試得LAMP LFD能特異性地檢測(cè)米氏凱倫藻;LAMP LFD對(duì)米氏凱倫藻基因組DNA的檢測(cè)限為1.70×10~(-4)ng·μL~(-1),靈敏度較常規(guī)PCR高100倍,對(duì)米氏凱倫藻LSU克隆質(zhì)粒檢測(cè)限為6.21×10~3copies·μL~(-1),其靈敏度是LAMP和SYBR Green I染料的10倍,是常規(guī)PCR的1000倍;模擬水樣檢測(cè)得LAMP LFD檢測(cè)限約為10~-11 cells·mL~(-1),其靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍。綜上所述,建立的LAMP LFD檢測(cè)方法是一種快速準(zhǔn)確的赤潮藻分子檢測(cè)技術(shù)。
【圖文】：

別進(jìn)行 PCR、LAMP、LAM采集的自然海水來著山東省有目標(biāo)藻種。通過浮游生物然海水混合，取 5 mL 藻細(xì)胞 104cells·mL 1密度的模擬 8 個(gè)梯度。使用一管式植物 粗提液為模板，分別進(jìn)行常規(guī)，以對(duì)比驗(yàn)證 LAMP LFD 模電泳驗(yàn)證，，SYBR Green I 染一個(gè)有陽性結(jié)果的稀釋度被取及濃度測(cè)定的基因組 DNA 通過 Ezup 柱

強(qiáng)壯前溝藻ITSPCR瓊脂糖凝膠（1%）電泳圖
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：X835

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本文編號(hào)：2680083