發(fā)布時間：2020-05-25 11:28

【摘要】：近年來,近海水域的富營養(yǎng)化程度越來越嚴(yán)重,導(dǎo)致全球性赤潮的爆發(fā)次數(shù)日益增多。赤潮的爆發(fā)不僅威脅人類健康,造成漁業(yè)巨大損失,還引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境和生態(tài)問題。因此,建立高效、靈敏的赤潮微藻的檢測方法很有必要。本論文以我國東海常見的3種赤潮藻,即強壯前溝藻(Amphidinium carterae)、鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)和米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)為目標(biāo),將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)與橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD)結(jié)合,分別建立其LAMP LFD檢測技術(shù)。論文以目標(biāo)藻轉(zhuǎn)錄內(nèi)間隔區(qū)(internal transcribed spacers,ITS)或核糖體大亞基(large subunit,LSU)為檢測靶標(biāo),首先通過基因組DNA提取和克隆測序獲得靶序列,根據(jù)靶序列進行LAMP引物和檢測探針的設(shè)計、合成與篩選;其次,建立目標(biāo)藻的LAMP LFD檢測體系,對LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化;最后對LAMP LFD技術(shù)的特異性、靈敏度及實用性進行驗證評估。對強壯前溝藻的ITS序列進行克隆,并用其設(shè)計1套LAMP引物及1條檢測探針;對LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化后用我國東海沿岸常見微藻作為受試對象,對LAMP LFD進行交叉反應(yīng)測試,表明LAMP LFD對強壯前溝藻具有特異性;分別以強壯前溝藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒為模板進行靈敏度測試,顯示LAMP LFD的檢測限分別為8.34×10~-44 ng·μL~(-1)和1.86×10~4 copies·μL~(-1),靈敏度均比常規(guī)PCR高100倍;模擬自然水樣測試得LAMP LFD對目標(biāo)藻的檢測限為約10 cells·mL~(-1),靈敏度比常規(guī)PCR高10倍。對鏈狀亞歷山大藻ITS序列進行克隆,以其為靶序列成功設(shè)計3套LAMP引物(AcLF1、AcLF2和AcLF3),篩選確定最優(yōu)引物AcLF2,并設(shè)計1條檢測探針;用最優(yōu)引物建立檢測體系并進行優(yōu)化;交叉反應(yīng)測試顯示LAMP LFD對鏈狀亞歷山大藻具有特異性;LAMP LFD對鏈狀亞歷山大藻基因組DNA和ITS克隆質(zhì)粒的檢測限為4.63×10~(-4)ng·μL~(-1)和1.26×10~4copies·μL~(-1),均顯示其靈敏度比常規(guī)PCR高100倍;模擬水樣測試顯示,LAMP LFD對目標(biāo)藻的檢測限約為10~-11 cells·mL~(-1),靈敏度較常規(guī)PCR高100倍�？寺∶资蟿P倫藻ITS序列,并用其設(shè)計2套LAMP引物(KmLF1和KmLF2),用實驗室前期獲得的LSU序列再設(shè)計2套引物(KmLF3和KmLF4),對4套引物進行篩選確定最優(yōu)引物KmLF3,并根據(jù)LSU序列設(shè)計1條檢測探針;優(yōu)化建立的LAMP體系;交叉反應(yīng)測試得LAMP LFD能特異性地檢測米氏凱倫藻;LAMP LFD對米氏凱倫藻基因組DNA的檢測限為1.70×10~(-4)ng·μL~(-1),靈敏度較常規(guī)PCR高100倍,對米氏凱倫藻LSU克隆質(zhì)粒檢測限為6.21×10~3copies·μL~(-1),其靈敏度是LAMP和SYBR Green I染料的10倍,是常規(guī)PCR的1000倍;模擬水樣檢測得LAMP LFD檢測限約為10~-11 cells·mL~(-1),其靈敏度是常規(guī)PCR的1000倍。綜上所述,建立的LAMP LFD檢測方法是一種快速準(zhǔn)確的赤潮藻分子檢測技術(shù)。
【圖文】：

別進行 PCR、LAMP、LAM采集的自然海水來著山東省有目標(biāo)藻種。通過浮游生物然海水混合，取 5 mL 藻細胞 104cells·mL 1密度的模擬 8 個梯度。使用一管式植物 粗提液為模板，分別進行常規(guī)，以對比驗證 LAMP LFD 模電泳驗證，，SYBR Green I 染一個有陽性結(jié)果的稀釋度被取及濃度測定的基因組 DNA 通過 Ezup 柱

強壯前溝藻ITSPCR瓊脂糖凝膠（1%）電泳圖
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：X835

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本文編號：2680083