發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 00:56

【摘要】：細(xì)菌磷酸三酯酶(PTEs)是降解殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的主要酶類,鑒于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留嚴(yán)重威脅到人類的健康,發(fā)展一種綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的方法將其從果蔬上移除,避免不必要農(nóng)業(yè)損失是科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)問題.目前發(fā)現(xiàn)的常溫PTEs,穩(wěn)定性差,易變,使用成本高,而嗜熱類磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶(Phosphotriesterase-like lactonases,PLLs)具有高溫反應(yīng)活性、對(duì)有機(jī)溶劑有強(qiáng)抗性、成本低等優(yōu)點(diǎn).同時(shí),PLLs具有較復(fù)雜的活性,包括能夠水解各種內(nèi)酯的內(nèi)酯酶活性和較弱的磷酸三酯酶活性.因而,PLLs既可成為降解殘留有機(jī)磷農(nóng)藥的重要靶標(biāo)蛋白,同時(shí)能夠通過水解內(nèi)酯等信號(hào)分子來調(diào)控群體反應(yīng)所引發(fā)的毒性基因表達(dá).大部分PLLs都來源于極端嗜熱的超嗜熱菌,由于其內(nèi)在的高熱穩(wěn)定性,在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中有很大優(yōu)勢.為深入了解酶的底物特異性,我們將基于PLLs的催化水解機(jī)理,對(duì)PLLs的三個(gè)家族成員:DrPLL(PLLs-B家族),SsoPox(PLLs-A家族)和Vmo Lac(PLLs-A家族)分別進(jìn)行分子對(duì)接和常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬,探究PLLs的非特異性底物的活力,并尋找能夠提高PLLs內(nèi)酯酶活性和磷酸三酯酶活性的方法.具體研究結(jié)果如下:(1)通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法,比較DrPLL-δ-nonanoiclactone(內(nèi)酯)和DrPLL-paraoxon(對(duì)氧磷)兩種復(fù)合物的構(gòu)象變化.結(jié)果表明:(Ⅰ)在DrPLL-δ-nonanoic lactone中,靠近Loop8的殘基運(yùn)動(dòng)明顯,構(gòu)象改變使內(nèi)酯的長疏水鏈能很好的結(jié)合在蛋白質(zhì)的疏水通道上,使其能較容易地進(jìn)入活性口袋,因此說明Dr PLL水解內(nèi)酯類底物的能力更強(qiáng).(Ⅱ)DrPLL中活性通道入口的Loop1構(gòu)象變化會(huì)影響對(duì)氧磷進(jìn)入活性口袋,對(duì)Loop1中殘基進(jìn)行突變(F26G/C72I)后,Loop1的構(gòu)象變化明顯減少,打破因Loop1構(gòu)象變化對(duì)通道入口的阻礙,從而能夠提高DrPLL催化對(duì)氧磷的效率.(2)通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法,比較undecanoic-γ-lactone(內(nèi)酯)和paraoxon(對(duì)氧磷)分別和野生型SsoPox與突變體(W263F/W263T)結(jié)合的構(gòu)象變化,闡述Loop8中重要?dú)埢鵚263的突變能夠提高SsoPox非特異性底物活力的原因,(Ⅰ)能夠影響門控殘基Phe229的構(gòu)象變化,導(dǎo)致活性口袋入口變寬(Phe229與Tyr99之間的距離變大),使對(duì)氧磷和內(nèi)酯更容易結(jié)合到蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)上;(Ⅱ)Asp256和Arg223形成氫鍵的幾率高于野生型(WT)SsoPox,使質(zhì)子在Asp256(位于Loop8)與Arg223(位于Loop7)之間的傳遞更加高效,因而能夠提高SsoPox水解底物的效率.(3)通過分子動(dòng)力學(xué)模擬方法,比較VmoLac-3-oxo-C10 AHL(長鏈內(nèi)酯),Vmo Lac-3-oxo-C6 AHL(短鏈內(nèi)酯),Vmo Lac-paraoxon(對(duì)氧磷)三種復(fù)合物結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)特征.結(jié)果表明,Vmo Lac對(duì)于長鏈內(nèi)酯底物(3-oxo-C10 AHL)有明顯的偏好,即VmoLac催化長鏈內(nèi)酯的能力更強(qiáng).結(jié)構(gòu)多樣性決定酶的復(fù)雜活性,我們的工作為提高嗜熱類磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶非特性底物活性提供了重要的理論依據(jù),并且對(duì)于高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥和抑制細(xì)胞交流過程中的毒性基因表達(dá)具有深遠(yuǎn)意義.
【圖文】：

合物農(nóng)藥的過量和長期連續(xù)使用，使許多地方的生態(tài)環(huán)境被有機(jī)磷化合物污染，嚴(yán)重威脅到人類的身體健康[5].有機(jī)磷化合物對(duì)于動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物以及無脊椎動(dòng)物有著很高的毒性，在世界各地每年都有數(shù)百萬人因有機(jī)磷化合物而中毒，其毒性原理如圖 1.1 所示[2, 4].

圖 1.2 脂肪�；�高絲氨酸內(nèi)酯(1-6), 的一般化學(xué)結(jié)構(gòu).1.3 嗜熱磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶從進(jìn)化本質(zhì)來說，每一種酶的進(jìn)化過程都是逐步穩(wěn)定發(fā)生的，沿著這一進(jìn)化過程已經(jīng)有人提出一種觀點(diǎn)：一個(gè)先祖酶可以隨意地進(jìn)行一個(gè)低水平的催化反應(yīng)，通過提供一個(gè)直接的選擇優(yōu)勢，促進(jìn)下一個(gè)新功能分支的產(chǎn)生.在 20 世紀(jì)時(shí)，為降解農(nóng)藥中的有機(jī)磷殺蟲劑而進(jìn)化出了磷酸三酯酶（PTE）[17]，此后許多科學(xué)家都在試圖追溯細(xì)菌磷酸三酯酶的起源.在 2006 年以色列教授 Tawfik取得突破性進(jìn)展，，首次發(fā)現(xiàn)一種新的酶類：嗜熱磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶（Phosphotriesterase-Like Lactonases , PLLs）[18, 19].PLLs 是一種具有弱磷酸三酯酶活性的天然內(nèi)酯酶，此類酶具有復(fù)雜的活性，包括內(nèi)酯酶活性（PLLs, EC3.1.1.25）和能夠降解有機(jī)磷化合物的磷酸三酯酶活性（PTEs, EC 3.1.8.1）[18,0].PLLs 能夠高效催化各種內(nèi)酯，包括脂肪酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q55;X592

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2675187