發(fā)布時間：2018-01-08 17:39

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌相關(guān)基因的篩選及功能分析初探　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC),又稱為大腸癌,是一種常見的消化道惡性腫瘤。在世界范圍內(nèi),結(jié)直腸癌的發(fā)病率在女性常見腫瘤中排第二位,在男性常見腫瘤中排第三位,是死亡率位居第二位的癌癥。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(international agency for research on cancer,IARC)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,2008年全球結(jié)直腸癌新診斷病例達(dá)120萬例,結(jié)直腸癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)占全部癌癥死亡人數(shù)的8%。近幾十年來,結(jié)直腸癌的整體發(fā)病率和死亡率都在逐年增高。尤其是在我國,隨著國民經(jīng)濟(jì)收入和生活質(zhì)量的提高以及生活習(xí)慣的改變,結(jié)直腸癌在中國人群中的發(fā)病率和死亡率均快速攀升,該病在我國已是發(fā)病率第三位和死亡率第五位的惡性腫瘤,逐漸成為威脅人民健康和生命的殺手。根據(jù)腫瘤的局部浸潤(T)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移(M)這三個要素的情況,學(xué)者們提出了結(jié)直腸癌的TNM分期。TNM I期和II期結(jié)直腸癌治愈希望較大,TNM I期病人的5年生存率達(dá)到了90%,但是如果癌細(xì)胞擴(kuò)散到淋巴結(jié)中(TNM III期)時,手術(shù)和放化療等治療手段只能使73%的病人獲得治愈的可能,當(dāng)腫瘤繼續(xù)發(fā)展至肝臟、肺等遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移時(TNM IV期),絕大多數(shù)病人已失去了根治性治療的可能性,其遠(yuǎn)期效果一般也極差。故早期診斷和治療是結(jié)直腸癌病人獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵所在。生物信息學(xué)是涉及多個領(lǐng)域的一門交叉學(xué)科,其核心內(nèi)容之一就是研究基因表達(dá)調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制,揭示人類疾病的本質(zhì)規(guī)律,為更快速、準(zhǔn)確的診斷和有效的治療疾病創(chuàng)造了條件。本研究旨在應(yīng)用基于芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析篩選出結(jié)直腸癌組織及其配對的癌旁非癌組織間的差異表達(dá)基因,同時搜索結(jié)直腸癌基因(即種子基因),繼續(xù)通過構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、重啟型隨機(jī)游走分析、富集分析和藥物—基因相互作用等手段探索出可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵作用基因并初步分析其功能。然后通過檢測關(guān)鍵基因在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,及其對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,來驗證生物信息學(xué)分析的結(jié)果,為進(jìn)一步研究關(guān)鍵基因在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制提供依據(jù),為找到應(yīng)用于結(jié)直腸癌診斷和治療的新基因靶點帶來了可能性。從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)下載到包括17對結(jié)直腸癌組織及其配對的癌旁非癌組織的基因芯片數(shù)據(jù)系列GSE32323后,結(jié)合Bioconductor中的AFFY軟件包和Brain Array Lab提供的Affy芯片探針注釋文件對表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。然后,用R語言中的limma軟件包對上述預(yù)處理過后的表達(dá)矩陣進(jìn)行差異表達(dá)分析,以篩選出結(jié)直腸癌組織及其配對的癌旁非癌組織間的差異表達(dá)基因。同時,從在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)數(shù)據(jù)庫中搜索了結(jié)直腸癌基因,即種子基因。隨后,在檢索相互作用基因的檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)數(shù)據(jù)庫下載了蛋白質(zhì)互相作用背景網(wǎng)絡(luò),并從中提取只包含種子基因和差異表達(dá)基因之間相互作用的子網(wǎng)絡(luò)命名為CRC.PPI網(wǎng)絡(luò);接著又使用R語言中的dnet軟件包進(jìn)行了重啟型隨機(jī)游走分析,識別出了CRC.PPI網(wǎng)絡(luò)中親和力分?jǐn)?shù)較高的前50個節(jié)點,并對前50個節(jié)點中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析;之后,通過DGIdb數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了藥物—基因互相作用分析,以尋找可能對我們關(guān)注的基因起到調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤藥物。利用PCR檢測結(jié)直腸癌組織和三個結(jié)直腸癌細(xì)胞系中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。然后,通過MTT等檢測關(guān)鍵基因沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞增殖的影響。最后,利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測了關(guān)鍵基因沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。我們得到了1640個差異表達(dá)的基因,這些差異表達(dá)基因中有850個是表達(dá)上調(diào)的,790個是表達(dá)下調(diào)的,并且從OMIM數(shù)據(jù)庫中搜索到了CCND1、AURKA和TLR4等25個種子基因。用STRING數(shù)據(jù)庫將CRC.PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建完成后,我們進(jìn)行了重啟型隨機(jī)游走分析,識別出了該網(wǎng)絡(luò)中親和力分?jǐn)?shù)較高的前50個節(jié)點,包括DEP結(jié)構(gòu)域含有雷帕霉素靶蛋白相互作用蛋白(DEP domain containing MTOR-interacting protein,DEPTOR),乳腺癌擴(kuò)增序列-1(breast carcinoma amplified sequence-1,BCAS1),神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 9,NEDD9)和有絲分裂原激活蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase 2,MAP2K2)等。在CRC.PPI網(wǎng)絡(luò)中親和力分?jǐn)?shù)較高的前50個節(jié)點包括14個上調(diào)基因,17個下調(diào)基因和19個無差異表達(dá)的基因,它們之間有224條相互作用的邊,包括DEPTOR-CCND1,AURKA-BCAS1,CCND1-BCAS1,CCND1-NEDD9和CCND1-MAP2K2等。我們從前50個節(jié)點中總共篩選出31個差異表達(dá)基因,其中只有5個是種子基因,另外26個是非種子基因。以p值小于0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn),我們利用DAVID在線工具對這31個差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),這31個基因主要富集在細(xì)胞周期階段(cell cycle phase;p=0.005651;涉及CCND1,NEDD9和AURKA),細(xì)胞周期(cell cycle;p=0.045692;涉及CCND1,NEDD9和AURKA)和細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)(intracellular signaling cascade;p=0.01978;涉及CCND1,MAP2K2和AURKA)等中。另外,KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)這31個基因還富集到了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction,p=0.04602)中。從DBIdb數(shù)據(jù)庫篩選可能作用于31個差異表達(dá)基因的藥物,發(fā)現(xiàn)只有3個基因(包括CCND1,AURKA和DEPTOR)存在可能的與它們表達(dá)變化逆向作用的藥物。鑒于生物信息學(xué)分析的結(jié)果表明差異表達(dá)基因CCND1,AURKA和NEDD9是親和度較高的節(jié)點且均富集到了細(xì)胞周期等多個重要的功能和通路中。因此,我們后續(xù)進(jìn)一步研究了這三種基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)和功能。應(yīng)用半定量PCR和/或?qū)崟r定量PCR檢測進(jìn)行實驗研究,發(fā)現(xiàn)CCND1,AURKA和NEDD9在結(jié)直腸癌組織和三個細(xì)胞系中都有不同程度的表達(dá)上調(diào),以AURKA最為顯著,CCND1次之。MTT、CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明,分別沉默AURKA和CCND1后SW480細(xì)胞的G1-S細(xì)胞周期進(jìn)程受抑制,導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力顯著下降;而且結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的凋亡增加。總而言之,我們嘗試了用各種生物信息學(xué)分析方法來挖掘結(jié)直腸癌相關(guān)的基因,用相關(guān)實驗技術(shù)檢測了關(guān)鍵基因在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況,并對這些關(guān)鍵基因進(jìn)行了初步功能分析探索。發(fā)現(xiàn)與正常樣本相比,在結(jié)直腸癌樣本中我們總共篩選到1640個差異表達(dá)基因。其中如DEPTOR,AURKA,CCND1,BCAS1,NEDD9和MAP2K2等親和度較高的基因可能通過影響細(xì)胞周期、參與信號通路等方式影響了結(jié)直腸惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。而且,我們檢測到了可能作用于CCND1,AURKA和DEPTOR的藥物。然而,這些都是通過生物信息學(xué)分析得到的預(yù)測性結(jié)果,需要通過實驗研究來進(jìn)一步驗證它們的準(zhǔn)確性。隨后,我們通過實驗檢測發(fā)現(xiàn)CCND1和AURKA在結(jié)直腸癌組織和SW480細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)。此外,AURKA或CCND1沉默后,SW480細(xì)胞的G1-S細(xì)胞周期進(jìn)程受抑制,導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力顯著下降;而且,SW480細(xì)胞的凋亡增加,提示AURKA和CCND1可能是結(jié)直腸腫瘤發(fā)病機(jī)制中的重要基因,并通過影響細(xì)胞周期來調(diào)控結(jié)直腸癌。這與前面生物信息學(xué)分析中關(guān)于關(guān)鍵基因篩選及其作用機(jī)制的結(jié)果基本一致。因此,我們目前的研究結(jié)果對今后進(jìn)一步深入探索結(jié)直腸癌的早期基因篩查和靶向治療有重要的啟示作用,也為分析、探索通過生物信息學(xué)篩選出來的其他差異表達(dá)基因在結(jié)直腸癌中的作用提供了前提和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：1398085