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Rats申請人:王瑩專業(yè):中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究方向:中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的機理研究導(dǎo)師:鞠大宏研究員中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所2013年5月北京原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文,是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立完成的,文中除注明引用的內(nèi)容外,不包含任何其他已經(jīng)發(fā)表的科研成果。對本文研究做出重要貢獻者,已在文中以明確方式表明。本聲明的法律責(zé)任完全由自己承擔(dān)。論文作者簽名:—至建導(dǎo)師簽名:蘭氫盍蒸關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明日期塑睦墮旦!!望本人完全知道中國中醫(yī)科學(xué)院有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允許被查閱和借閱。本人授權(quán)中國中醫(yī)科學(xué)院可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索,可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名:氆日期墊!壘墨月!!旦目錄摘要……………………………………………………………………………………………………………………….1ABSTRACT……………………………………………………………………………………………………………….7文獻綜述……………………………………………………………………………………..11前言…………….……………………………………………………………………………………………………一2—17日U 舌…………….……………………………………………………………………………………………………….材料與方法…………………………………………………………………………………一29 1.1實驗動物…………………………………………………………………………………29 1.2藥物………………………………………………………………………………………….29 1.3主要試劑…………………………………………………………………………………29 1.4主要儀器…………………………………………………………………………………29 2方法………………………………………………………………………………………………………………………30 2.1分組及處理………………………………………………………………………………30 2.2指標(biāo)的檢測方法…………………………………………………………………………30 2.3統(tǒng)計學(xué)分析………………………………………………………………………………34結(jié)果……………………………………………………………………………………………………………………..35 1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的影響………..35 1.1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TBV%的影響…………………………35 1.2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TRS%的影響…………………………36 1.3巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TFS%和MAR的影響……………….37 1.4巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨mAR和OSW的影響……………….38 2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG和RANKL蛋白表達的影響…………………………………………………………………………………………………………………………40 2.1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達的影響…40 2.2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達的影響41 3巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠外周血清中IL.1、IL.6含量的影響………..43討論……………………………………………………………………………………………………………………..45 1中醫(yī)機理的探討…………………………………………………………………………一45 2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對破骨細胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL的調(diào)節(jié)作用………47 3巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對外周血清中IL一1、IL一6的調(diào)節(jié)作用……………………48參考文獻……………………………………………………………………………………..49結(jié)論……………………………………………………………………………………………………………………..51致謝………………………………………………………………………………………..53個人簡歷……………………………………………………………………………………..55巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用及機理探討摘要目的采用骨組織形態(tài)計量學(xué)的方法,觀察具有溫補腎陽作用的單味中藥.巴戟天、葫蘆巴和補骨脂,對去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用,以篩選出對其具有預(yù)防作用的藥物;并從破骨細胞分化調(diào)控因子OPG/RANKL和對骨代謝具有重要調(diào)節(jié)作用的IL.1、IL.6的角度,初步闡明其作用機理,進一步為中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松癥提供實驗依據(jù)。方法選用雌性Wistar大鼠83只,隨機分為3組:空白對照組12只,假手術(shù)組12只,造模組59只。在術(shù)后1個月,將造模組大鼠隨機分為5組,即模型組、陽性對照組、巴戟天組和葫蘆巴組,每組各12只,補骨脂組11只。然后,開始灌胃給藥:各中藥組給予濃度為19生藥/ml的水煎劑,給藥體積為5.6ml/kg體重,即給藥劑量均為5.69生藥/kg體重;陽性對照組給予0.008mg/ml的己烯雌酚,給藥體積為5.6ml/kg體重。以上給藥1天1次,連續(xù)6天,休息1天后,如此給藥3個月�？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組按同法灌服等體積的蒸餾水。各組大鼠于處死前15天和前3天分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重,對骨進行熒光標(biāo)記。給藥結(jié)束后,將大鼠以45mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,股動脈取血,用于檢測外周血清中IL.1、IL.6的含量。然后,將各組大鼠處死,取右側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片,用于骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的檢測;取左側(cè)脛骨制作冰凍切片,用于成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG和RANKL蛋白表達的檢測。統(tǒng)計學(xué)處理方法:實驗結(jié)果皆以均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差(x士s)表示,采用單因素方差分析(ANOVA)進行處理,組間兩兩比較,采用g檢驗。結(jié)果1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的影響1.1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TBV%的影響模型組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組明顯降低。與模型組比較,巴戟天組、補骨脂組和陽性對照組的大鼠脛骨TBV%顯著增加;而葫蘆巴組則無顯著性差異。巴戟天組、葫l中國中醫(yī)科學(xué)院-'-OO九級碩士研究生學(xué)位論文蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨TBV%明顯低于假手術(shù)組;陽性對照組較假手術(shù)組則無顯著性差異。結(jié)果見表1。表1各組大鼠脛骨TBV%的變化注:與假手術(shù)組比較:木P<0.05,棗木尸<O.01;與模型組比較:△P<0.05,△△P<0.01。下同。1.2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TRS%的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨TRS%明顯增高。巴戟天組、補骨脂組和陽性對照組較模型組大鼠脛骨TRS%明顯降低;葫蘆巴組較模型組無顯著性變化。巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨TRS%較假手術(shù)組顯著增高;陽性對照組較假手術(shù)組則無顯著性差異。結(jié)果見表2。表2各組大鼠脛骨TRS%的變化1.3巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨TFS%和MAR的影響模型組大鼠脛骨TFS%和MAR均明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比,巴戟天組、2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用及機理探討補骨脂組和陽性對照組大鼠脛骨TFS%和MAR顯著降低;葫蘆巴組無顯著性差異。與假手術(shù)組相比,巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨TFS%均顯著增高:陽性對照組無明顯差異。巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨MAR高于假手術(shù)組;陽性對照組則無明顯差異。結(jié)果見表3。表3各組大鼠脛骨TFS%和MAR的變化1.4巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨mAR和OSW的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨mAR顯著升高。與模型組相比,陽性對照組大鼠脛骨mAR明顯降低:巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組無明顯差異。葫蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨mAR明顯高于假手術(shù)組;巴戟天組和陽性對照組較假手術(shù)組無顯著性差巳開。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨OSW顯著升高。與模型組相比,陽性對照組大鼠脛骨OSW明顯降低;巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組無明顯差異。葫蘆巴組OSW明顯高于假手術(shù)組;巴戟天組、補骨脂組和陽性對照組較假手術(shù)組無顯著性差異。結(jié)果見表4。中國中醫(yī)科學(xué)院-:-OO九級碩士研究生學(xué)位論文表4各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG和RANKL蛋白表達的影響2.1巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG蛋白表達均明顯下調(diào)。與模型組相比,補骨脂組和陽性對照組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞0PG蛋白表達明顯上調(diào);巴戟天組和葫蘆巴組無顯著差異。巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組較假手術(shù)組明顯下調(diào):陽性對照組與假手術(shù)組相比,無明顯差異。結(jié)果見表5。表5 各組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG蛋白表達的變化2.2巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達的影響模型組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白表達明顯高于假手術(shù)組。巴戟天組、補骨脂組和陽性對照組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白表達較4巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用及機理探討模型組顯著下調(diào);葫蘆巴組無顯著性變化。與假手術(shù)組相比,葫蘆巴組大鼠脛骨成骨細胞RANKL蛋白表達上調(diào);巴戟天組、葫蘆巴組和補骨脂組大鼠脛骨骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白表達上調(diào);巴戟天組和補骨脂組大鼠脛骨成骨細胞RANKL蛋白表達較假手術(shù)組無顯著性差異。陽性對照組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白表達與假手術(shù)相比,均無明顯差異。結(jié)果見表6。表6各組大鼠脛骨成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞RANKL蛋白表達的變化3巴戟天、葫蘆巴和補骨脂對去卵巢大鼠外周血清中IL.1、IL.6含量的影響與假手術(shù)組相比,模型組大鼠外周血清中IL.1含量顯著增高。與模型組相比,補骨脂組和陽性對照組大鼠外周血清中IL.1含量明顯降低;其它各給藥組則無顯著性變化。巴戟天組、葫蘆巴組以及補骨脂組大鼠外周血清中IL.1含量較假手術(shù)組均顯著升高;陽性對照組無明顯差異。模型組大鼠外周血清中IL.6含量高于假手術(shù)組。與模型組相比,巴戟天組、補骨脂組及陽性對照組大鼠外周血清中IL.6含量較模型組明顯降低;葫蘆巴組則無顯著性差異。與假手術(shù)組相比,巴戟天組、葫蘆巴組以及補骨脂組大鼠外周血清中IL.6含量明顯增高:陽性對照組無明顯差異。結(jié)果見表7。中國中醫(yī)科學(xué)院二oo九級碩士研究生學(xué)位論文表7各組大鼠外周血清中IL.1、IL.6含量的變化結(jié)論(1)巴戟天和補骨脂能在一定程度上抑制去除大鼠卵巢所致的骨的高轉(zhuǎn)換,阻止骨量丟失,對骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防作用;葫蘆巴對去卵巢所致的大鼠骨質(zhì)疏松癥無明顯的預(yù)防作用。(2)補骨脂不僅能夠提高成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG的蛋白表達,而且能抑制其RANKL的蛋白表達;此外,還可降低外周血中IL.1、IL.6的水平,從而達到對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用。(3)巴戟天的作用途徑是通過降低成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞RANKL的蛋白表達,使之與RANK的結(jié)合減少,進而抑制破骨細胞的分化、成熟及活性,防止骨的過度吸收,并對IL.6也有一定的抑制作用。(4)葫蘆巴對成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞OPG和RANKL的蛋白表達以及IL.1、IL.6水平均無明顯影響。關(guān)鍵閘:巴戟天;葫蘆巴;補骨脂;去卵巢大鼠;骨質(zhì)疏松癥

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