發(fā)布時間：2020-12-11 07:13

　　目的探討肝再生增強(qiáng)因子（Augmenter of liver regeneration,ALR）對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法用限制性內(nèi)切酶Sac I單酶切重組質(zhì)粒pPICZαA-rhALR使其線性化后電轉(zhuǎn)入酵母菌GS115中,在含博來霉素的YPD平板上篩選出高拷貝陽性轉(zhuǎn)化酵母菌落,以甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)rhALR。經(jīng)鎳柱親和層析純化表達(dá)的上清蛋白,再用SDS-PAGE膠電泳和Western Blot鑒定。CCK-8檢測獲得rhALR對人肝癌細(xì)胞HepG2的促增殖活性。利用細(xì)胞貼壁分離法體外分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過連續(xù)傳代達(dá)到一步步純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的目的,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,利用流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志物以鑒定細(xì)胞的純度;CCK-8法檢測不同濃度ALR（1-100ug/mL）組與陰性對照組作用于小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48h后對細(xì)胞增殖的影響;使用堿性磷酸酶檢測試劑盒檢測ALR組和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組誘導(dǎo)7天后堿性磷酸酶活性變化;采用茜素紅染色檢測ALR組和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組成骨誘導(dǎo)14天后鈣結(jié)節(jié)形成情況,并利用實時熒光定量PCR法檢測ALR組和對照組成骨... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pPICZαA-rhALR的酶切鑒定

22圖 2 重組質(zhì)粒 pPICZαA-rhALR 測序結(jié)果Figure 2 Squencing analysis of pPICZαA-rhALR3.2 重組酵母菌表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化利用高拷貝重組菌在甲醇誘導(dǎo)下可分泌表達(dá) rhALR。目的蛋白分子量約為17.5kD（帶 His-tag）。為提高蛋白表達(dá)量，我們選用了不同的誘導(dǎo)時間 24h，48h，96h。實驗證實誘導(dǎo)表達(dá)時間達(dá)到 96h 時，目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。收集分泌表達(dá)的上清蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 膠電泳，后行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果見圖 3。

A 空質(zhì)粒上清液蛋白 B 誘導(dǎo)后上清液蛋白 C 誘導(dǎo)前上清液蛋白 M Marker圖 3 SDS-PAGE 膠電泳分析 rhALR 的表達(dá)igure 3 The analysis of the rhALR expression by SDS-PAGE gel electrophoresis產(chǎn)物 Western Blot 鑒定進(jìn)一步驗證表達(dá)上清里誘導(dǎo)出的分子量約 17.5kD 的蛋白為 rhALR。對品做 Western Blot 分析，首先上樣跑 SDS-PAGE 電泳并考馬斯亮藍(lán)染且均一的目的條帶，分子量約為 17.5Kd。后進(jìn)行重新上樣電泳-轉(zhuǎn)膜-封，二抗-顯影，利用 ALR 特異性抗體檢測到單一條帶。證實 rhALR 在功地分泌表達(dá)，且甲醇誘導(dǎo) 96h 時表達(dá)量最高。見圖 4。M a b c dA B

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: An update on their phenotype in vivo and in vitro[J]. Patrick C Baer.  World Journal of Stem Cells. 2014(03)
[2]Osteogenic potential: comparison between bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Han-Tsung Liao,Chien-Tzung Chen.  World Journal of Stem Cells. 2014(03)



本文編號：2910112