發(fā)布時(shí)間：2020-11-13 02:51

　　 第一部分:脫細(xì)胞骨軟骨基質(zhì)支架的制備及相關(guān)研究目的:制備多種兔脫細(xì)胞骨軟骨支架,并對(duì)這些支架進(jìn)行脫細(xì)胞效果、成份、結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)測(cè)試等研究,為組織工程構(gòu)造骨軟骨復(fù)合物建立基礎(chǔ)。方法:利用物理、化學(xué)、酶類聯(lián)合脫細(xì)胞方法,對(duì)兔股骨滑車關(guān)節(jié)和肋骨軟骨整體進(jìn)行脫細(xì)胞處理,獲得整體骨軟骨支架,將兔股骨滑車關(guān)節(jié)和肋兩個(gè)部位骨軟骨按照透明軟骨、鈣化軟骨層、軟骨下骨三層結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離粉碎,對(duì)三層微粒進(jìn)行脫細(xì)胞處理,重新交聯(lián)制備關(guān)節(jié)和肋來源的分層骨軟骨支架。對(duì)整體骨軟骨支架進(jìn)行組織學(xué)染色,熒光比色法對(duì)整體支架各分層微粒進(jìn)行殘留DNA含量測(cè)定,驗(yàn)證脫細(xì)胞程度。利用氨基酸分析儀和熒光比色法對(duì)三層微粒中氨基酸和糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)進(jìn)行定量分析,XRD衍射儀對(duì)羥基磷灰石進(jìn)行定量分析,并與天然骨軟骨進(jìn)行對(duì)比。檢測(cè)三種支架密度、孔隙率、孔徑、吸水率等物理參數(shù),拉扭復(fù)合力學(xué)測(cè)試機(jī)檢測(cè)三種支架在干燥、濕潤(rùn)狀態(tài)下的彈性極限、強(qiáng)度極限、彈性模量、脆性等力學(xué)機(jī)械性能,并和天然骨軟骨進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果:本方法脫細(xì)胞程度較為徹底。相比天然骨軟骨組織,脫細(xì)胞過程損失了約20~30%的氨基酸,損失了30~40%的GAG,但無(wú)機(jī)物并無(wú)損失。相比整體支架,分層支架的密度較小,孔隙率、孔徑、吸水率更大。相比天然骨軟骨組織,無(wú)論干燥或濕潤(rùn)狀態(tài),兩種支架機(jī)械性能均差,且分層支架差距更大。結(jié)論:本研究聯(lián)合脫細(xì)胞效果較為徹底,但有機(jī)成分有所損失。脫細(xì)胞整體支架與分層支架相比天然組織,機(jī)械性能均有不同程度下降,提示結(jié)構(gòu)(尤其超微結(jié)構(gòu))和成份的完整性對(duì)生物力學(xué)性能影響至關(guān)重要。第二部分:脫細(xì)胞骨軟骨支架負(fù)載兔IPFP-SC的相關(guān)體外研究目的:分離提取兔髕下脂肪墊間充質(zhì)干細(xì)胞(IPFP-SC)并對(duì)之鑒定,檢測(cè)骨軟骨支架的生物相容性、細(xì)胞毒性,研究骨軟骨基質(zhì)成份、結(jié)構(gòu)對(duì)IPFP-SC向成骨、成軟骨分化的影響。初步探討利用脫細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行生物3D打印。方法:利用膠原酶消化法和貼壁培養(yǎng)法分離提取出IPFP-SC,根據(jù)細(xì)胞表面分子流式細(xì)胞分析(FACS)、免疫熒光(IF)鑒定表型,檢測(cè)其成骨、成軟骨、成脂分化能力。制作兔膝OA模型,比較健康與OA兔IPFP-SC在增殖、遷移、成軟骨方面的區(qū)別。利用直接接種法、直接植入法、浸提液培養(yǎng)法驗(yàn)證多種脫細(xì)胞骨軟骨支架的生物相容性與細(xì)胞毒性。檢測(cè)支架骨、軟骨的仿生結(jié)構(gòu)和骨、軟骨組織成份對(duì)IPFP-SC向成骨、成軟骨方向誘導(dǎo)的作用。利用Micro-CT掃描和天狼星染色連續(xù)切面圖像數(shù)字化方式,獲得兔天然骨軟骨的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),制作STL格式文件,對(duì)利用脫細(xì)胞基質(zhì)生物3D打印進(jìn)行初步探討。結(jié)果:所提取細(xì)胞,FACS及IF驗(yàn)證表達(dá)CD73+、CD90+、CD105+、CD 44+、CD34-、CD45-、HLADR-,可向成骨、成軟骨、成脂分化。OA個(gè)體IPFP-SC相比健康個(gè)體,在增殖方面無(wú)顯著差別,遷移及成軟骨能力較弱。三種脫細(xì)胞支架生物相容性良好,無(wú)細(xì)胞毒性。骨軟骨的結(jié)構(gòu)、成份均可促進(jìn)IPFP-SC向成骨、成軟骨方向分化。得到的骨軟骨結(jié)構(gòu)STL文件可以較好的模擬打印出天然組織。結(jié)論:所提取細(xì)胞證實(shí)為間充質(zhì)干細(xì)胞,OA個(gè)體IPFP-SC遷移及成軟骨能力較弱可能是影響軟骨修復(fù)的原因。脫細(xì)胞支架的仿生結(jié)構(gòu)和組成成份均影響著IPFP-SC向成骨、成軟骨分化,這為IPFP-SC體內(nèi)誘導(dǎo)為目的細(xì)胞打下了基礎(chǔ)第三部分:脫細(xì)胞骨軟骨支架負(fù)載兔IPFP-SC修復(fù)兔骨軟骨缺損目的:通過將負(fù)載IPFP-SC的三種脫細(xì)胞骨軟骨支架復(fù)合體植入兔股骨滑車骨軟骨缺損模型中,研究三種組織工程方法修復(fù)骨軟骨缺損的效果。方法:制作42例標(biāo)準(zhǔn)兔股骨滑車關(guān)節(jié)骨軟骨缺損模型。分別將脫細(xì)胞關(guān)節(jié)整體骨軟骨支架、脫細(xì)胞關(guān)節(jié)分層骨軟骨支架、脫細(xì)胞肋分層骨軟骨支架三種支架分為3組,組內(nèi)分為負(fù)載或不負(fù)載IPFP-SC的亞組,除空白組共6小組,隨機(jī)分配植入骨缺損模型中。術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月處死實(shí)驗(yàn)兔取得標(biāo)本,大體觀察修復(fù)組織的軟骨面及軟骨下骨面,石蠟切片進(jìn)行HE、天狼猩紅、番紅固綠、甲苯胺藍(lán)染色,比較各種組織工程方法修復(fù)骨軟骨損傷的效果。結(jié)果:總體修復(fù)效果,負(fù)載IPFP-SC組優(yōu)于單純支架組,空白組最差,軟骨修復(fù)方面,分層支架組優(yōu)于整體支架組,軟骨下骨修復(fù)方面則相反。1月時(shí),除空白組外,各組間差異不大,3月、6月時(shí),包括空白組,各組差異最明顯。結(jié)論:三種組織工程構(gòu)造方式對(duì)骨軟骨缺損均能起到一定的修復(fù)作用,其中分層支架修復(fù)軟骨能力較強(qiáng),整體支架修復(fù)軟骨下骨能力較強(qiáng)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R318.08
【部分圖文】：

圖 1-1：兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)骨軟骨整體取出術(shù)（A.兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口及劃線示意圖；B.切開皮膚及皮下；C.注意避開關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)血管及其分支；D.進(jìn)入關(guān)節(jié)囊內(nèi)；E.暴露股骨滑車部分；F.環(huán)鉆鉆取滑車中部骨軟骨）

圖 1-1：兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)骨軟骨整體取出術(shù)關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口及劃線示意圖；B.切開皮膚及皮下；C.注意避開關(guān)節(jié)囊內(nèi)側(cè)血管及其分D.進(jìn)入關(guān)節(jié)囊內(nèi)；E.暴露股骨滑車部分；F.環(huán)鉆鉆取滑車中部骨軟骨）

圖 1-3：兔關(guān)節(jié)骨軟骨和肋骨軟骨整體脫細(xì)胞流程圖（2）關(guān)節(jié)和肋骨軟骨三層微粒的脫細(xì)胞處理由于分層制作的組織顆粒對(duì)外形要求并不嚴(yán)格，將健康兔麻醉過量處死后，無(wú)菌取出兔股骨滑車、髁部關(guān)節(jié)骨軟骨和 1~10 肋骨軟骨，放入生理鹽水備用。按以下處理流程（圖 1-4）對(duì)兔關(guān)節(jié)和肋骨軟骨進(jìn)行三層結(jié)構(gòu)微粒的脫細(xì)胞處理。①將切取的骨軟骨去除附著的其他組織，去離子水反復(fù)沖洗 5 遍直至清亮。切削表面 HC，當(dāng)切削時(shí)感覺從彈性及韌性慢慢變堅(jiān)硬，觀察切面顏色變黃，此為 CC，繼續(xù)切削 CC，直至發(fā)現(xiàn)有血樣組織，此時(shí)切削有磨砂感，此為 SB；切除肋骨骨皮質(zhì)及骨膜、軟骨膜，此時(shí) HC 和 CC 輕輕震蕩即可脫離，將肉眼可見的 CC 切下即可。將三層結(jié)構(gòu)分別取下后，切碎至 2mm×2mm×2mm 大小。② 將組織微粒置于去離子水浸泡至完全淹沒，放置于-80℃冷凍 8 h 后取出，放置于 37℃烘箱下完全融化后，再放置于超聲清洗機(jī)內(nèi)，超聲功率 100%，溫度 20℃，時(shí)間 20 min，超聲清洗完畢后，再次以去離子水沖洗 3 遍直至液體清亮。以上步驟反復(fù) 3 次。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 徐銘恩;;生物3D打印——打印生命的希望[J];杭州科技;2013年05期

2 卓大宏;;世界衛(wèi)生組織公布第二個(gè)“骨關(guān)節(jié)10年(2010~2020)”——促進(jìn)肌骨關(guān)節(jié)健康,讓人們可以恒動(dòng)而不衰[J];中國(guó)矯形外科雜志;2011年16期

本文編號(hào)：2881613