發(fā)布時(shí)間：2020-11-12 07:04

　　 目的:構(gòu)建載有細(xì)胞的正交多層有序排列組織工程角膜基質(zhì),檢測(cè)其特征和活性,探索機(jī)械力壓縮及拉伸含角膜基質(zhì)細(xì)胞的膠原及多層疊加手段,構(gòu)建與自然角膜接近的仿生組織工程角膜基質(zhì)并進(jìn)行動(dòng)物移植,探明構(gòu)建的組織工程角膜基質(zhì)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)變化規(guī)律。方法:以原代提取的,體外擴(kuò)增至第五代的新西蘭白兔角膜基質(zhì)細(xì)胞(CSCs)作為組織工程角膜基質(zhì)構(gòu)建的種子細(xì)胞。利用塑壓膠原和拉伸膠原的技術(shù),構(gòu)建載有細(xì)胞的正交排列的4層壓縮膠原(CC)和拉伸壓縮膠原(SCC),并用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)。然后CC和SCC進(jìn)行7天的體外培養(yǎng),進(jìn)行透光度和機(jī)械強(qiáng)度試驗(yàn)。通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)CC和SCC的表面和內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。利用活死細(xì)胞雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在CC和SCC中的存活率。通過(guò)熒光染色測(cè)量細(xì)胞的排列和長(zhǎng)度。通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的空間排列結(jié)構(gòu)。WB和qPCR檢測(cè)CC、SCC和平板培養(yǎng)(TCP)中細(xì)胞的基因表達(dá)變化。RNA-seq檢測(cè)全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)差異,根據(jù)差異表達(dá)基因(DEGs)推測(cè)分子和通路的變化。最后通過(guò)兔角膜基質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組織工程角膜基質(zhì)的生物相容性和活性。結(jié)果:水化的CC、水化的SCC以及天然角膜基質(zhì)的平均透光率分別為63.7%、73.8%和76.5%,脫水的CC、SCC和天然角膜基質(zhì)平均透光率分別為87.7%、89.7%和98.5%。脫水的CC和脫水的SCC的拉伸強(qiáng)度分別為12.86±1.77 MPa和17.38±1.06 MPa。CC和SCC中CSCs的存活率分別為(83.5±3.7)%和(80.3±2.6)%,細(xì)胞長(zhǎng)度分別為108.0±28.4μm和133.2±36.1μm。CC中的細(xì)胞為無(wú)序排列,SCC中的細(xì)胞為有序排列,分布在±30°之間。SEM和TEM顯示,CC中膠原纖維呈無(wú)序排列,而SCC中膠原纖維呈有序排列。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,SCC中細(xì)胞呈多層正交排列,CC中細(xì)胞為無(wú)序排列。WB和qPCR結(jié)果顯示,與TCP組相比,CD34、lumican在CC和SCC中上調(diào),I型膠原、α-SMA和β-actin下調(diào)。ACTA2、COL1A1、FN1、VIM、MKI67、SNAI1、G0S2顯著性下調(diào),LUM和DCN顯著性上調(diào)。流式結(jié)果顯示,CC、SCC和TCP中細(xì)胞在G0/G1期的比例分別為56.0±2.9%、55.7±1.9%和49.9±1.4%,在S期的比例分別為24.9±0.3%、24.5±1.4%和34.8±2.3%,在G2/M期的比例分別為18.6±2.8%、19.5±0.5%和15.2±0.9%。CC和SCC在G0/G1和G2/M期的比例顯著提升,在S期的比例顯著下調(diào)。RNA-seq結(jié)果顯示,以TCP作為對(duì)照組,CC中有2440個(gè)基因下調(diào),2324個(gè)基因上調(diào);SCC中有2445個(gè)基因下調(diào),2346個(gè)基因上調(diào)。以CC作為對(duì)照組,SCC中有58個(gè)基因下調(diào),55個(gè)基因上調(diào)。細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制相關(guān)信號(hào)通路下調(diào),FoxO、PI3K-Akt、axon guidance、MAPK等信號(hào)通路顯著性上調(diào)。細(xì)胞骨架、膠原、激活、增殖等相關(guān)基因下調(diào),基質(zhì)金屬蛋白酶和間隙連接相關(guān)基因上調(diào)。體內(nèi)研究表明,CC和SCC在移植入兔角膜基質(zhì)6周后,透明度越來(lái)越高。CC和SCC中有細(xì)胞,對(duì)照組無(wú)細(xì)胞進(jìn)入。且CC和SCC中細(xì)胞能正常表達(dá)CD34和vimentin,不表達(dá)α-SMA,CC與SCC和組織相容性較好。結(jié)論:通過(guò)機(jī)械力壓縮及拉伸含角膜基質(zhì)細(xì)胞的膠原,制作了仿生組織工程角膜基質(zhì)層,其具有多層有序正交排列、安靜型基質(zhì)細(xì)胞和良好的生物相容性。不僅為今后的角膜和其他組織工程器官的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)和思路,而且提供了角膜和其他結(jié)締組織發(fā)育、生長(zhǎng)、重塑、再生和纖維化病理相關(guān)有價(jià)值的新見(jiàn)解。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R318
【部分圖文】：

他們具有良好的機(jī)械性能，而且利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和重塑，但是不人工設(shè)計(jì)成想要的形狀和特性。一些組織工程材料要求分層、有序排列的微構(gòu)、細(xì)胞分布各向異性等，這就需要人工設(shè)計(jì)的組織工程結(jié)締組織支架滿(mǎn)足特點(diǎn)。塑壓膠原(plastic compressed collagen)，由 Brown 等人[44]在 2005 年發(fā)明一種較為理想的膠原組織工程制作方法。它的主要原理是通過(guò)外部壓力，快將膠原凝膠中的水分?jǐn)D出，使膠原凝膠的密度和機(jī)械強(qiáng)度提升，而且可以控縮時(shí)間調(diào)整膠原凝膠的密度和水分。這種方法可以在幾分鐘之內(nèi)最多排出 水分，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的活性不會(huì)造成太大的影響[44]。一般地，整個(gè)塑壓膠原自上而下由配重、玻璃板、濾紙、尼龍網(wǎng)、膠原凝膠、尼龍網(wǎng)、濾紙組成。通過(guò)玻璃板將壓力均勻分散到膠原凝膠上，使其中的水分壓出，導(dǎo)致凝膠的(圖 1-1)。

he result of immunofluorescence in P0 CSCs and P5 CSCs. Keraressed in P0 CSCs. The signal of these two proteins is decreased in-related proteins collagen I and α-SMA are up-regulated in P5. P0 C α-SMA. Bar scale: 20 μm.CSCs 和第 5 代 CSCs 的 western blot 鑒定 的 CSCs 和 P5 的 CSCs，提取全細(xì)胞蛋白，進(jìn)行 wester、CD34、lumican、collagen I 和 α-SMA 的表達(dá)水平進(jìn)行檢果如圖 2-2。在 P0 的 CSCs 中，keratocyte 相關(guān)表型 kerat而在 P5 中幾乎檢測(cè)不到這兩個(gè)蛋白的信號(hào)。P0 和 P5 的成纖維細(xì)胞相關(guān)表型 collagen I 和 α-SMA，但在 P0 的

22圖 3-1.CC 和 SCC 的制作過(guò)程。(a)第 5 代的 CSCs 收集入 15ml 離心管中，加入 9ml0.5%預(yù)冷的膠原溶液和 1ml10×DMEM，充分混勻。(b)離心除氣泡，將膠原轉(zhuǎn)移至 3.5cm×3.5cm×2cm 的模具中，37°C 孵育 30min 使膠原溶液凝結(jié)。(c)取出膠原凝膠，在其兩側(cè)加上尼龍片。(d)膠原凝膠進(jìn)行壓縮，兩側(cè)分別加上尼龍網(wǎng)和濾紙，最后蓋上玻璃板，100g 的砝碼對(duì)其進(jìn)行壓縮，制成 CC。(e)當(dāng)壓縮完成時(shí)，用拉伸機(jī)對(duì)膠原膜進(jìn)行 1.2 倍長(zhǎng)度拉伸，即得到 SCC。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2880430