發(fā)布時間：2020-11-11 05:08

　　 目的:制備純鈦表面重組人生長因子DOPA-IGF1涂層,構建鈦片表面同時兼?zhèn)浯龠M細胞早期黏附狀態(tài)和成骨活性的單一材料涂層。研究DOPA-IGF1對鈦片表面兔骨髓間充質干細胞成骨分化的影響,以期為種植體表面改性提供新的研究方向。方法:1、對攜有重組人生長因子DOPA-IGF1目的基因的菌種進行表達和純化,通過SDS-PAGE電泳水凝膠對純化后蛋白DOPA-IGF1進行鑒定。2、利用對目標蛋白DOPA-IGF1的羥化,將其固定在鈦片表面,構建涂層體系。通過掃描電鏡(SEM)觀察各組鈦片的表面形貌、X線能譜分析(EDX)測定各組試樣表面元素組成,對各組鈦片進行表征。3、采用全骨髓貼壁法提取兔骨髓間充質干細胞(rBMSCs),傳代培養(yǎng)至第三代時通過細胞增殖實驗(CCK-8)測定增殖曲線,對其進行成骨誘導后,通過茜素紅染色和成骨相關基因檢測驗證其成骨分化潛能。4、通過CCK-8實驗、熒光染色檢測各組涂層鈦片,研究DOAP-IGF1對rBMSCs增殖和早期粘附狀態(tài)的影響。5、通過堿性磷酸酶(ALP)實驗對共培養(yǎng)成骨誘導后ALP表達水平的測定和對成骨相關基因Runx2、BMP2、Col-a1相對表達量的測定,探究DOPA-IGF1對rBMSCs成骨相關活性的影響。結果:1、成功提取并培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞,顯微鏡下觀察細胞呈長梭形有序排列,成骨誘導后驗證了其成骨分化潛能。2、掃描電鏡、X線能譜分析結果表明,本實驗成功在鈦片表面制備DOPA-IGF1涂層,并表現(xiàn)出理想的涂層形貌。3、CCK-8實驗結果顯示,細胞增殖速率為DOPA-IGF1組IGF-1組TI組(P0.05),TI組與CG組增殖率無顯著差別(P0.05)。結果表明,本實驗所用鈦片對rBMSCs的生長無明顯影響,DOPA-IGF1涂層能夠顯著促進鈦片表面rBMSCs的早期增殖。4、熒光染色結果顯示,IGF-1組與TI組細胞形態(tài)相近,呈團塊狀,激動蛋白微絲不清晰;DOPA-IGF1組細胞較其他兩組細胞伸展出的偽足多,肌動蛋白微絲清晰可見,細胞延展性更好。5、ALP實驗結果顯示,隨細胞培養(yǎng)時間延長,四組細胞的堿性磷酸酶活性逐漸增強。堿性磷酸酶活性DOPA-IGF1組IGF-1組TI組,TI組與CG組無顯著差別,DOPA-IGF1組與IGF-1組差異顯著(P0.05),DOPA-IGF1組與TI組和CG組相比差異顯著(P0.05)。6、成骨相關基因檢測結果顯示,在成骨誘導4、7d時DOPA-IGF1組3種成骨相關基因表達均增強,且與其他組相比差異顯著(P0.05)。結論1、成功提取并培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞并對其鑒定,結果顯示實驗所提取細胞的生物學特性與干細胞相符合。2、成功構建覆DOPA-IGF1及覆IGF-1涂層的實驗組件,通過掃描電鏡與X線能譜分析對涂層進行表征。3、通過細胞實驗證明DOPA-IGF1對rBMSCs早期增殖的促進作用,初步證實其促成骨作用,但其促成骨機制和效果尚需進一步研究。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R783.1
【部分圖文】：

第 3 章 實驗結果 兔骨髓間充質干細胞提取、培養(yǎng)和鑒定.1 rBMSCs 提取和培養(yǎng)結果顯微鏡下觀察原代（P0）rBMSCs 生長緩慢，多表現(xiàn)為散落、三角形形態(tài)，其間混有圓形、類圓形雜質細胞，見圖 3.1（代（P3）rBMSCs 生長速度明顯加快，細胞集落間相互融合密排列，呈輻射狀或菊花狀，細胞大小形態(tài)均勻，呈長梭形3.1（B）。

顯微鏡下觀察 rBMSCs 成骨誘導后茜素紅化結果 Ni-NTA 填料的親和層析柱進行純化依然留有高濃度的咪唑。使用填料為脫鹽純化。蛋白表達和純化過程中的檢測分析。DOPA-IGF1 的理論分子子量一致，DOPA-IGF1 以可溶狀態(tài)表白濃度為 498.63ug/ml。結果表明，本長因子 DOPA-IGF1。

圖 3.2 倒置顯微鏡下觀察 rBMSCs 成骨誘導后茜素紅染色（×100）3.2 蛋白表達純化結果上清液經過 Ni-NTA 填料的親和層析柱進行純化。表達和純程后，蛋白質中依然留有高濃度的咪唑。使用填料為 Sephadex 脫鹽柱進一步脫鹽純化。蛋白表達和純化過程中的所有組分SDS-PAGE 電泳檢測分析。DOPA-IGF1 的理論分子量是 10.7kd 泳圖中的蛋白分子量一致，DOPA-IGF1 以可溶狀態(tài)表達，見圖 BCA 法測定蛋白濃度為 498.63ug/ml。結果表明，本實驗成功表純化了重組人生長因子 DOPA-IGF1。
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本文編號：2878788