發(fā)布時間：2018-07-12 12:36

  本文選題：韌帶 + 骨髓間充質(zhì)干細胞�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：目的 非常嚴重的韌帶損傷無法自行修復，往往需要韌帶的重建。但無論自體或異體的韌帶移植物及合成材料均不能取得滿意結果。組織工程學的興起為韌帶重建提供了一條新的途徑。組織工程學韌帶構建包括建立韌帶形態(tài)的支架結構，培養(yǎng)種子細胞并在支架上生長和產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，對原來的支架進行改建，最終形成具有自我更新和修復能力的韌帶組織。脫細胞韌帶支架通過脫去細胞成分，基本消除了免疫源性，同時保留天然韌帶的形態(tài)和結構，生物力學性能未受影響。作為一種天然支架材料受到廣泛關注。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal cells，BMSCs）是目前比較熱門的種子細胞，體外能快速擴增。有實驗表明堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）可促進骨髓間充質(zhì)干細胞生長和分泌韌帶特異性細胞外基質(zhì)。通過轉基因治療基因轉導入生長因子基因并在體內(nèi)改良種子細胞及改變體內(nèi)微環(huán)境來促進器官組織的形成，是目前組織工程中研究的熱點。本研究利用腺病毒載體將堿性成纖維細胞生長基因轉入骨髓間充質(zhì)干細與脫細胞韌帶支架復合培養(yǎng)共同構建組織工程韌帶。 方法 1．分離、培養(yǎng)兔BMSCs和韌帶成纖維細胞（ligament fibroblast，LF）。并對BMSCs細胞進行鑒定 分別通過骨髓穿刺Ficoll密度梯度離心法和組織塊培養(yǎng)法分離兔骨髓間充質(zhì)干細胞和髕韌帶成纖維細胞。MTT法檢測兩種細胞的增殖活性。通過成骨，成軟骨，成脂肪細胞多向分化能力的測定來鑒定BMSCs。 2．Gateway技術構建攜帶人bFGF基因的重組腺病毒載體(pAd-bFGF-GFP) 構建只需兩步：BP反應構建入門克隆，LR反應創(chuàng)建表達克隆。表達克隆在293細胞包裝成目標腺病毒。測定病毒滴度。擴增腺病毒載體轉染293細胞后realtimeRT-PCR及westernblot檢測bFGF的表達。 3.pAd-bFGF-GFP轉染兔骨髓間充質(zhì)干細胞后測定培養(yǎng)液中bFGF的表達和對細胞增值及分泌細胞外基質(zhì)的影響及與韌帶成纖維細胞的比較 攜帶bFGF基因的腺病毒用不同MOI值來轉染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，通過流式細胞儀檢測轉染效率。 MTT法檢測轉染后骨髓間充質(zhì)干細胞增殖來確定最佳MOI值。以最佳MOI值轉染骨髓間充質(zhì)干細胞，ELISA檢測bFGF蛋白表達、分泌趨勢。將攜帶bFGF目的基因腺病毒轉染的BMSCs（pAd-bFGF-GFP.BMSCs）、LF，BMSCs，轉染空病毒的BMSCs（pAd-GFP-BMSCs）進行MTT細胞增殖比較。Realtime RT-PCR檢測bFGF對BMSCs表達Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ、波形蛋白（Vimentin）在mRNA水平的影響。 4．韌帶脫細胞處理，并進行組織學及生物力學檢測； 1%DCA法進行韌帶脫細胞處理。將pAd-bFGF-GFP.BMSCs,LF， BMSCs，pAd-GFP-BMSCs種植脫細胞韌帶支架，MTT法檢測種子細胞在脫細胞支架上的黏附、生長、增殖情況。Realtime RT-PCR檢測種子細胞Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ和Vimentin蛋白mRNA水平的表達。組織學切片，冰凍切片和共聚焦顯微鏡觀察pAd-bFGF-GFP.BMSCs在支架的生長分布情況。生物力學檢測體外復合培養(yǎng)對韌帶機械性能的影響。 結果 1．分離培養(yǎng)的BMSCs與LF在大體形態(tài)學上相似，均表現(xiàn)為長梭形、漩渦樣生長。MTT檢測結果顯示BMSCs的增殖活性明顯優(yōu)于LF。BMSCs具有向成骨，成脂肪，成軟骨多向分化能力。 2．成功構建了攜帶人bFGF基因的質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和基因測序表明成功合成和整合了人bFGF基因。用重組質(zhì)粒腺病毒載體系統(tǒng)成功構建了重組腺病毒pAd.bFGF-GFP。通過在293細胞內(nèi)的擴增，我們得到了高滴度的病毒,滴度測定為（4.85×109ifu/ml）。realtime RT-PCR及Western-blot證實目的基因bFGF在基因水平和蛋白水平高效表達。 3．腺病毒對BMSCs細胞有很高的轉染效率，MTT結果顯示MOI值為200時，BMSCs細胞具有最強的增值能力。ELISA檢測顯示：轉染后48h bFGF就已經(jīng)顯著表達，分泌高峰出現(xiàn)在第7天，此后逐漸下降,2周時仍檢測到。pAd-bFGF-GFP轉染BMSCs與其他細胞相比具有更強的細胞增值能力。培養(yǎng)2周后Realtime RT-PCR檢測顯示Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA表達均顯著高于其他組。VimentinmRNA表達與LF相當。 4． MTT法檢測顯示種子細胞與脫細胞支架復合培養(yǎng)后bFGF基因轉染骨髓間充質(zhì)干細胞后能明顯促進細胞生長。Realtime PCR顯示pAd-bFGF-GFP轉染BMSCs的Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ表達均顯著高于其他組。Vimentin mRNA表達與成纖維細胞相當。HE染色和冰凍切片共聚焦顯微鏡觀察pAd-bFGF-GFP-BMSCs在脫細胞韌帶纖維間生長良好，呈梭形生長。生物力學檢測顯示復合培養(yǎng)脫細胞韌帶與未培養(yǎng)韌帶相比最大應力沒有差別，彈性模量降低。 結論 1．成功分離培養(yǎng)獲得兔骨髓間充質(zhì)干細胞和韌帶成纖維細胞，并通過分化培養(yǎng)鑒定確認獲得具有多向分化能力的BMSCs。成纖維細胞的獲取創(chuàng)傷較大。 2．成功構建了攜帶人bFGF基因的高滴度缺陷型重組腺病毒。 3．轉染bFGF基因的BMSCs細胞能持續(xù)分泌bFGF至少兩周，具有很強的增值能力和表達韌帶特異性細胞外基質(zhì)蛋白mRNA能力，優(yōu)于韌帶成纖維細胞和BMSCs細胞和轉染空病毒的BMSCs細胞， 4．體外轉基因BMSCs能在脫細胞韌帶上良好生長，并能大量表達韌帶特異性的基質(zhì)蛋白mRNA，優(yōu)于韌帶成纖維細胞和BMSCs細胞和轉染空病毒的BMSCs細胞，生物力學性能基本保留。
[Abstract]:objective
A very serious ligament injury can not be repaired by itself and often requires the reconstruction of ligaments. However, neither autologous or allograft ligaments and synthetic materials can achieve satisfactory results. The rise of tissue engineering provides a new way for the reconstruction of ligaments. Tissue engineering ligament construction includes the scaffolding of the form of ligaments. The seed cells grow and produce the extracellular matrix on the scaffold, and the original scaffold is rebuilt to form the ligamentous tissue with the ability of self renewal and repair. The acellular ligament scaffold eliminates the immune origin by removing the cell components, while retaining the morphology and structure of natural toughened bands, and the biomechanical properties are not affected. As a natural scaffold material, bone marrow mesenchymal cells (BMSCs) is one of the most popular seed cells and can be rapidly expanded in vitro. Some experiments have shown that basic fibroblast growth factor (bFGF) can promote the growth of bone marrow mesenchymal stem cells and the secretion of ligamentous extracellular matrix. It is a hot spot in tissue engineering to promote the formation of organ tissue by transferring gene transfected gene into the growth factor gene and improving the seed cells in the body and changing the microenvironment of the body in the body. This study uses adenovirus vector to transfer the basic fibroblast growth gene into the bone marrow mesenchymal stem and decellular ligaments. The structure of tissue engineering ligament was constructed by composite culture.
Method
1. isolation, culture of rabbit BMSCs and ligament fibroblast (LF) and identification of BMSCs cells.
The proliferation activity of two cells was detected by.MTT method of bone marrow mesenchymal stem cells and patellar ligament fibroblasts by Ficoll density gradient centrifugation and tissue mass culture method. BMSCs. was identified by bone formation, cartilage formation, and adipocyte differentiation ability.
Construction of recombinant adenovirus vector carrying human bFGF gene (pAd-bFGF-GFP) by 2.Gateway Technology
The construction needed only two steps: the BP reaction was used to construct an introductory clone, the LR reaction was used to create the expression clone. The expression of the clone was packed into the target adenovirus in 293 cells. The virus titer was measured. The expression of bFGF was detected by realtimeRT-PCR and Westernblot after the adenovirus vector was transfected into 293 cells.
Expression of bFGF in cultured rabbit bone marrow mesenchymal stem cells after transfection of 3.pAd-bFGF-GFP and its effect on cell proliferation and extracellular matrix and comparison with ligamentous fibroblasts
The adenovirus carrying the bFGF gene transfected rabbit bone marrow mesenchymal stem cells with different MOI values. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. The optimal MOI value was determined by MTT assay. The optimal MOI value was used to transfect bone marrow mesenchymal stem cells. ELISA was used to detect the expression of bFGF protein and the secretion trend. BFGF will be carried with the order of bFGF. Gene adenovirus transfected with BMSCs (pAd-bFGF-GFP.BMSCs), LF, BMSCs, BMSCs (pAd-GFP-BMSCs) transfected with empty virus (pAd-GFP-BMSCs), MTT cell proliferation compared.Realtime RT-PCR detection bFGF to BMSCs expression Collagen I, Collagen III, and vimentin at the level of response.
4. the acellular ligament was treated with histological and biomechanical examination.
1%DCA method for acellular disposal of ligaments. PAd-bFGF-GFP.BMSCs, LF, BMSCs, pAd-GFP-BMSCs were planted with acellular ligament scaffolds. MTT method was used to detect the adhesion, growth and proliferation of seed cells on the decellular scaffold..Realtime RT-PCR was used to detect the expression of Collagen III, Collagen I and Vimentin protein mRNA level. Tissue section, ice The growth and distribution of pAd-bFGF-GFP.BMSCs on the scaffold were observed by the frozen section and confocal microscope. The effects of the combined culture on the mechanical properties of the ligaments were examined by biomechanics.
Result
1. the BMSCs and LF were similar in morphology, and all showed long spindle shape. The.MTT detection results of vortex like growth showed that the proliferation activity of BMSCs was obviously superior to that of LF.BMSCs, which had the ability to differentiate into osteogenesis, adipose and cartilage.
2. the plasmid carrying human bFGF gene was successfully constructed. PCR identification and gene sequencing of the recombinant plasmid showed that the human bFGF gene was successfully synthesized and integrated. The recombinant adenovirus vector system successfully constructed the recombinant adenovirus pAd.bFGF-GFP. by amplification in 293 cells, and we got a high titer virus, and the titer determination was (4.). 85 * 109ifu/ml).Realtime RT-PCR and Western-blot confirmed that the target gene bFGF was highly expressed at the gene level and protein level.
3. adenovirus has high transfection efficiency to BMSCs cells. MTT results show that when MOI value is 200, BMSCs cells have the strongest increment ability.ELISA detection: 48h bFGF has been expressed significantly after transfection, the peak of secretion appears at seventh days, then gradually decreases, and.PAd-bFGF-GFP transfected BMSCs is still compared with other cells at 2 weeks. After 2 weeks of culture, Realtime RT-PCR detection showed that the expression of Collagen I and Collagen III mRNA were significantly higher than those of other groups, and the expression of.VimentinmRNA was equivalent to that of LF.
The 4.MTT assay showed that after the bFGF gene was transfected into the bone marrow mesenchymal stem cells, the cell growth was obviously promoted by the transfection of the bone marrow mesenchymal stem cells, and the.Realtime PCR showed the Collagen III of the pAd-bFGF-GFP transfected BMSCs. The expression of Collagen I was significantly higher than the.Vimentin mRNA expression of other groups and the equivalent.HE dyeing and ice of the fibroblasts. The frozen section confocal microscope observed that pAd-bFGF-GFP-BMSCs grew well between the acellular ligament fibers, and showed spindle growth. The biomechanical test showed that the maximum stress of the ACL was not different from that of the uncultured ligaments, and the modulus of elasticity decreased.
conclusion
1. the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells and ligamentous fibroblasts were successfully isolated and cultured. Through differentiation and culture identification, the acquisition of BMSCs. fibroblasts with multiple differentiation ability was confirmed.
2. a recombinant adenovirus with high titer defect was successfully constructed with human bFGF gene.
3. BMSCs cells transfected with bFGF gene can continuously secrete bFGF for at least two weeks, and have strong value-added ability and expression of ligamentous extracellular matrix protein mRNA, which are superior to ligamentum fibroblasts and BMSCs cells and BMSCs cells transfected with empty viruses.
4. in vitro transgenic BMSCs can grow well on the acellular ligament, and can express a large number of ligamentous specific matrix protein mRNA, which is superior to the ligamentum fibroblasts and BMSCs cells and the BMSCs cells transfected with null virus, and the biomechanical properties are basically retained.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R318.17

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本文編號：2117180