XIST、G3BP2和NFAT5調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生的機(jī)制研究
發(fā)布時(shí)間：2020-12-07 22:45
目的:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是顱內(nèi)惡性度最高的原發(fā)性腫瘤。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床治療手段主要包括手術(shù)切除以及術(shù)后的放療、化療。然而,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期并未隨著醫(yī)療技術(shù)的改善而相應(yīng)的延長(zhǎng)。血管新生促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的演進(jìn),因此靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生的治療方案有潛在的應(yīng)用前景。然而血腫瘤屏障的存在,極大地限制了大分子化療藥物進(jìn)入腫瘤組織,降低了療效。因此增加血腫瘤屏障通透性并抑制膠質(zhì)瘤血管新生可能成為一種更有效的膠質(zhì)瘤治療手段。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成是內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管新生的重要過(guò)程。同時(shí),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞是血腫瘤屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此靶向調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為可能調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管新生及血腫瘤屏障的通透性。敲減長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST,抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)其凋亡。而XIST是否調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、管腔形成及血腫瘤屏障通透性未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。RNA結(jié)合蛋白G3BP2可調(diào)控肝細(xì)胞癌和乳腺癌的生物學(xué)行為。而G3BP2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的調(diào)控作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌大量促血管生成因子,從而營(yíng)造了強(qiáng)烈的...
【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省
【文章頁(yè)數(shù)】：117 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
第一部分 長(zhǎng)鏈非編碼RNAXIST通過(guò)靶向miR-137調(diào)節(jié)血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤血管新生的機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
2.2.2 細(xì)胞凍存
2.2.3 細(xì)胞復(fù)蘇
2.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)
2.2.5 體外血腫瘤屏障模型的建立
2.2.6 Trizol法提取RNA
2.2.7 Real-timePCR方法分別檢測(cè)XIST、miR-137及FOXC1mRNA的表達(dá)變化
2.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
2.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
2.2.10 跨內(nèi)皮阻抗值（TEER）的測(cè)量
2.2.11 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）滲出量的測(cè)定
2.2.12 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）
2.2.13 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
2.2.14 內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.15 Westernblot
2.2.16 免疫熒光
2.2.17 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）
2.2.18 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 XIST在GECs中高表達(dá),在GECs中敲減XIST的表達(dá)增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.2 XIST結(jié)合miR-137,XIST與miR-137相互負(fù)性抑制
3.3 miR-137參與XIST對(duì)BTB通透性和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生的調(diào)控
3.4 miR-137在GECs中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-137增加BTB通透性,抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.5 miR-137靶向調(diào)節(jié)ZO-2和FOXC1的表達(dá)
3.6 FOXC1在GECs中高表達(dá),敲減FOXC1的表達(dá)增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.7 過(guò)表達(dá)FOXC1通過(guò)結(jié)合ZO-1、occludin和CXCR7的啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)上述蛋白的表達(dá)
3.8 FOXC1參與miR-137對(duì)BTB通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的調(diào)控。
4 討論
5 結(jié)論
第二部分 ：RNA結(jié)合蛋白G3BP2通過(guò)增加HEIH的穩(wěn)定性促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞血管新生機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
2.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）
2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)G3BP2、HEIH、IRF6、CYR61過(guò)表達(dá)及表達(dá)沉默的細(xì)胞系及分組
2.2.4 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤條件培養(yǎng)基的制備
2.2.5 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）、內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.6 Westernblot
2.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
2.2.8 基質(zhì)膠栓體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 G3BP2在GECs中高表達(dá),敲減G3BP2抑制GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成
3.2 敲減G3BP2下調(diào)GECs中HEIH的表達(dá)水平,并降低HEIH的穩(wěn)定性
3.3 HEIH在GECs中高表達(dá),過(guò)表達(dá)HEIH促進(jìn)GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成
3.4 HEIH參與了G3BP2對(duì)GECs細(xì)胞活力、遷移及管腔形成等生物學(xué)行為的調(diào)控
3.5 HEIH以SMD的方式下調(diào)IRF6的表達(dá)
3.6 IRF6在GECs低表達(dá),過(guò)表達(dá)IRF6抑制GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成能力
3.7 HEIH通過(guò)靶向IRF6的3'-UTR區(qū)促進(jìn)GECs血管新生
3.8 IRF6在轉(zhuǎn)錄水平抑制CYR61的表達(dá)
3.9 CYR61在GECs高表達(dá),敲減CYR61抑制GECs血管新生
3.10 聯(lián)合敲減G3BP2及HEIH的表達(dá)抑制體內(nèi)GECs血管新生
4 討論
5 結(jié)論
第三部分 ：轉(zhuǎn)錄因子NFAT5調(diào)節(jié)SBF2-AS1/miR-338-3p介導(dǎo)的EGFL7的表達(dá)改變促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)的血管新生機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
2.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）
2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)NFAT5、SBF2-AS1表達(dá)沉默的細(xì)胞系及分組
2.2.4 瞬轉(zhuǎn)miR-338-3p過(guò)表達(dá)與沉默及分組
2.2.5 SBF2-AS1與miR-338-3p共轉(zhuǎn)染
2.2.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)EGFL7過(guò)表達(dá)細(xì)胞系,隨后與miR-338-3p雙重轉(zhuǎn)染
2.2.7 膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基的制備
2.2.8 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）、內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.9 Westernblot
2.2.10 雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析
2.2.11 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
2.2.12 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 NFAT5的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的WHO臨床分級(jí)正相關(guān)
3.2 敲減U87及U118細(xì)胞中的NFAT5的表達(dá),抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生
3.3 SBF2-AS1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),敲減U87及U118細(xì)胞中的SBF2-AS1的表達(dá),抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的體外血管新生
3.4 NFAT5在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)SBF2-AS1的表達(dá)
3.5 SBF2-AS1參與了NFAT5對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生的調(diào)控
3.6 SBF2-AS1吸附miR-338-3p,而miR-338-3p參與了SBF2-AS1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生的調(diào)控
3.7 上調(diào)miR-338-3p通過(guò)靶向EGFL7的3’UTR區(qū)抑制EGFL7的表達(dá)及分泌
3.8 上調(diào)miR-338-3p通過(guò)靶向EGFL7的3’-UTR區(qū)抑制EGFL7誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.9 敲減NFAT5及SBF2-AS1的表達(dá)抑制U87及U118細(xì)胞中EGFL7的表達(dá)及分泌,但不影響EGFL7的mRNA水平
3.10 聯(lián)合敲減NFAT5及SBF2-AS1抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤移植瘤生長(zhǎng)的效果最顯著
4 討論
5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)介
本文編號(hào)：2904013
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【學(xué)位級(jí)別】：博士
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摘要
Abstract
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第一部分 長(zhǎng)鏈非編碼RNAXIST通過(guò)靶向miR-137調(diào)節(jié)血腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤血管新生的機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
2.2.2 細(xì)胞凍存
2.2.3 細(xì)胞復(fù)蘇
2.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)
2.2.5 體外血腫瘤屏障模型的建立
2.2.6 Trizol法提取RNA
2.2.7 Real-timePCR方法分別檢測(cè)XIST、miR-137及FOXC1mRNA的表達(dá)變化
2.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
2.2.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
2.2.10 跨內(nèi)皮阻抗值（TEER）的測(cè)量
2.2.11 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）滲出量的測(cè)定
2.2.12 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）
2.2.13 內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
2.2.14 內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.15 Westernblot
2.2.16 免疫熒光
2.2.17 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）
2.2.18 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 XIST在GECs中高表達(dá),在GECs中敲減XIST的表達(dá)增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.2 XIST結(jié)合miR-137,XIST與miR-137相互負(fù)性抑制
3.3 miR-137參與XIST對(duì)BTB通透性和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生的調(diào)控
3.4 miR-137在GECs中低表達(dá),過(guò)表達(dá)miR-137增加BTB通透性,抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.5 miR-137靶向調(diào)節(jié)ZO-2和FOXC1的表達(dá)
3.6 FOXC1在GECs中高表達(dá),敲減FOXC1的表達(dá)增加BTB通透性并抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.7 過(guò)表達(dá)FOXC1通過(guò)結(jié)合ZO-1、occludin和CXCR7的啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)上述蛋白的表達(dá)
3.8 FOXC1參與miR-137對(duì)BTB通透性和膠質(zhì)瘤血管新生的調(diào)控。
4 討論
5 結(jié)論
第二部分 ：RNA結(jié)合蛋白G3BP2通過(guò)增加HEIH的穩(wěn)定性促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤內(nèi)皮細(xì)胞血管新生機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
2.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）
2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)G3BP2、HEIH、IRF6、CYR61過(guò)表達(dá)及表達(dá)沉默的細(xì)胞系及分組
2.2.4 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤條件培養(yǎng)基的制備
2.2.5 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）、內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.6 Westernblot
2.2.7 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
2.2.8 基質(zhì)膠栓體內(nèi)血管生成實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 G3BP2在GECs中高表達(dá),敲減G3BP2抑制GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成
3.2 敲減G3BP2下調(diào)GECs中HEIH的表達(dá)水平,并降低HEIH的穩(wěn)定性
3.3 HEIH在GECs中高表達(dá),過(guò)表達(dá)HEIH促進(jìn)GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成
3.4 HEIH參與了G3BP2對(duì)GECs細(xì)胞活力、遷移及管腔形成等生物學(xué)行為的調(diào)控
3.5 HEIH以SMD的方式下調(diào)IRF6的表達(dá)
3.6 IRF6在GECs低表達(dá),過(guò)表達(dá)IRF6抑制GECs的細(xì)胞活力、遷移及管腔形成能力
3.7 HEIH通過(guò)靶向IRF6的3'-UTR區(qū)促進(jìn)GECs血管新生
3.8 IRF6在轉(zhuǎn)錄水平抑制CYR61的表達(dá)
3.9 CYR61在GECs高表達(dá),敲減CYR61抑制GECs血管新生
3.10 聯(lián)合敲減G3BP2及HEIH的表達(dá)抑制體內(nèi)GECs血管新生
4 討論
5 結(jié)論
第三部分 ：轉(zhuǎn)錄因子NFAT5調(diào)節(jié)SBF2-AS1/miR-338-3p介導(dǎo)的EGFL7的表達(dá)改變促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤誘導(dǎo)的血管新生機(jī)制研究
1 前言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.2 主要試劑
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇
2.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）
2.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn)NFAT5、SBF2-AS1表達(dá)沉默的細(xì)胞系及分組
2.2.4 瞬轉(zhuǎn)miR-338-3p過(guò)表達(dá)與沉默及分組
2.2.5 SBF2-AS1與miR-338-3p共轉(zhuǎn)染
2.2.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)EGFL7過(guò)表達(dá)細(xì)胞系,隨后與miR-338-3p雙重轉(zhuǎn)染
2.2.7 膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基的制備
2.2.8 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）、內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)
2.2.9 Westernblot
2.2.10 雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析
2.2.11 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）
2.2.12 裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 NFAT5的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的WHO臨床分級(jí)正相關(guān)
3.2 敲減U87及U118細(xì)胞中的NFAT5的表達(dá),抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生
3.3 SBF2-AS1在膠質(zhì)瘤中高表達(dá),敲減U87及U118細(xì)胞中的SBF2-AS1的表達(dá),抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的體外血管新生
3.4 NFAT5在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)SBF2-AS1的表達(dá)
3.5 SBF2-AS1參與了NFAT5對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生的調(diào)控
3.6 SBF2-AS1吸附miR-338-3p,而miR-338-3p參與了SBF2-AS1對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生的調(diào)控
3.7 上調(diào)miR-338-3p通過(guò)靶向EGFL7的3’UTR區(qū)抑制EGFL7的表達(dá)及分泌
3.8 上調(diào)miR-338-3p通過(guò)靶向EGFL7的3’-UTR區(qū)抑制EGFL7誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管新生
3.9 敲減NFAT5及SBF2-AS1的表達(dá)抑制U87及U118細(xì)胞中EGFL7的表達(dá)及分泌,但不影響EGFL7的mRNA水平
3.10 聯(lián)合敲減NFAT5及SBF2-AS1抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤移植瘤生長(zhǎng)的效果最顯著
4 討論
5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
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攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
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本文編號(hào)：2904013
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