發(fā)布時間：2020-06-10 22:51

【摘要】：帕金森病(PD)是一種高度異質(zhì)性疾病,主要是由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性以及紋狀體多巴胺含量明顯減少所致。PD發(fā)病進程緩慢,病人表征無明顯變化,不同的患者病情之間存在很大差異,目前尚未出現(xiàn)治愈方法。P2受體參與機體多種炎癥、免疫機制等生理功能調(diào)控。其亞型P2X7受體屬ATP生理性受體,可通過與胞外ATP受體結(jié)合可逆的開啟陽離子通道。P2X7受體是介導各類痛覺調(diào)控機制的主力軍,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)外周傷害性炎癥反應的放大、產(chǎn)生痛覺相關信號。PD疼痛的發(fā)生會伴隨認知障礙的出現(xiàn)。近年來,有實驗表明,P2X7受體在認知功能障礙中也具有一定的作用。結(jié)合本實驗室前提工作,部分數(shù)據(jù)表明,PD痛閾低于正常大鼠,并伴有認知功能障礙。本研究利用生物信息學分析對大鼠P2受體基因初步鑒定分析表達,篩選出表達量高的P2受體亞型,通過6-OHDA誘導的PD模型大鼠,利用小動物行為分析系統(tǒng)記錄帕金森大鼠在水迷宮行為學變化中的具體表現(xiàn),從mRNA的角度繼續(xù)闡明P2X7受體與帕金森認知功能調(diào)控中的互作機制,并且落腳于P2X7受體的生理特性,通過P2X7受體的激動劑BzATP和拮抗劑BBG,綜合應用蛋白生物學等技術手段,在核酸、蛋白和整體動物等不同層面,通過免疫印跡技術對P2X7受體進行定性和半定量,著重于研究P2X7受體的表達對PD大鼠認知功能障礙的作用及影響。以豐富PD認知功能障礙的作用機理,旨在為臨床上治療PD病人認知功能障礙提供科學的實驗依據(jù),也為探明認知功能調(diào)控生理生化機制奠定基礎。主要結(jié)果如下:1.激活或抑制P2X7受體誘導PD大鼠認知功能在行為表現(xiàn)上的變化PD模型大鼠認知功能障礙明顯大于正常大鼠,通過BBG給藥后,PD組學習記憶功能增強,在有效區(qū)停留時間延長;經(jīng)過BzATP給藥處理后,PD組的認知功能障礙加重,在定位航行實驗中,BzATP組尋找并爬上平臺的時間高于其余組的大鼠,表明激活P2X7受體可加重PD組的認知功能障礙。2.P2X7受體參與了PD大鼠認知功能障礙的變化調(diào)控對各組海馬組織P2受體進行PCR擴增檢測發(fā)現(xiàn):僅P2X7受體的表達較顯著,其余P2受體亞型表達效果不同。BzATP組的PD模型大鼠海馬組織的P2X7受體表達量最高,而BBG組則低于PD組模型大鼠海馬中P2X7受體的表達量。對各組海馬組織蛋白中P2X7受體做免疫印跡實驗后,發(fā)現(xiàn)P2X7受體在BBG組表達量較PD組下調(diào),BzATP組大鼠海馬組織表達的蛋白量較PD組上調(diào)。通過qRT-PCR和免疫印跡實驗,驗證了BzATP和BBG可以有效激活和抑制PD大鼠海馬組織中P2X7受體的表達;結(jié)果表明P2X7受體在PD大鼠海馬組織的mRNA水平和蛋白水平表達結(jié)果相似,P2X7受體可能在PD模型大鼠認知功能障礙中起負反饋調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

圖 1.1 帕金森的發(fā)病機制示意圖Fig. 1.1 Pathogenesis of Parkinson's diseasePD 的潛在發(fā)病機制尚未完全闡明，但有幾個關鍵機制與此有關，包括(1)神經(jīng)炎癥；(2)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導的興奮性毒性；(3)由于 Cav1.3 通道表達增加而改變鈣穩(wěn)態(tài)；(4)線粒體功能障礙、氧化應激和凋亡、細胞死亡；(5)神經(jīng)營養(yǎng)支持缺失；(6)α-突觸核蛋白（α-syn）折疊錯誤、積累和聚集成毒性低聚物，，并通過類似朊病毒的機制傳播；(7)增加富含亮氨酸的重復激酶 2(lrrk2)激酶活性。ATP=腺苷 5′-三磷酸；ca2+=鈣；GDNF=神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；GRFα=GDNF 家族受體 α；JNK=C-JUN N 末端激酶；RET=在轉(zhuǎn)染受體酪氨酸激酶期間重新排列；ROS=活性氧物種。尖箭頭表示正調(diào)節(jié)，鈍箭頭表示負調(diào)節(jié)。運動障礙伴隨著情感和情緒的障礙，Benzagmout 等人利用血氧水平依賴的功能性磁共振成像對 PD 患者進行情緒評估，結(jié)果顯示在枕葉-顳皮層、島葉、球體功能控制過程中，參與情緒加工的前額葉皮層、基底節(jié)區(qū)和頂葉皮層被激活，產(chǎn)生的情緒會激發(fā)更多的情緒。與情緒障礙相關的 PD 被越來越多地認為是致殘性的運動癥狀[9]。這些發(fā)現(xiàn)有助于臨床醫(yī)生認識 PD 患者的情緒障礙，從而更早的對病情做出

2.3.1 大鼠 P2 受體的染色體定位分析在 RGD 大鼠基因數(shù)據(jù)庫中鑒定到 P2 家族 15 個基因的基本信息，并對染色體進行初步定位，得知 P2 家族基因存在于 1 號、2 號、3 號、10 號、11 號、12 號以及 X 染色體上；P2X 受體亞型的外顯子數(shù)量多，為 12~14 個，P2Y 受體亞型的外顯子數(shù)量少，P2Y1 和 P2Y13 的外顯子數(shù)僅為 2，P2Y6 有 8 個外顯子。通過 MG2C 軟件，進一步對 P2 家族基因的染色體進行定位，結(jié)果如圖 2.3.1 所示。利用 expasy在線軟件預測大鼠 P2 受體的等電點，結(jié)合大鼠 P2 受體的染色體信息，得到表 2-5。P2Y 受體普遍比 P2X 受體的等電點高。除 P2Y4 和 P2Y10 位于 X 染色體上，其余基因皆位于常染色體上。且 2 號染色體上分布的基因最多：P2Y1、P2Y12、P2Y13、P2Y14，出現(xiàn)了基因聚類現(xiàn)象；12 號染色體上分布的基因較多，為 P2X2、P2X4、P2X7；其余染色體上分布的基因為 1~2 條。此外，P2Y2 和 P2Y6、P2X1 和 P2X5也出現(xiàn)了基因聚類現(xiàn)象，分別緊密的排列在 1 號、10 號染色體上。
【學位授予單位】：延安大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.5

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1 姜威;李月玲;俞明;陳R

本文編號：2706972